Nat Comm | 基于PASEF-DIA技术的新冠肺炎免疫应答机制研究

2021-01-28 11:03:41, 多层组学定制服务上海欧易生物医学科技有限公司

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鹿明

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自从新冠肺炎爆发以来，一系列的科研论文都针对该疾病从不同的角度进行了细致的分析，取得了一定的成果。近日，来自北京大学多组学研究中心的黄超兰课题组及其合作课题组在Nature Communications上发表了基于DIA-PASEF技术（timsTOF pro质谱仪）的4D定量蛋白质组学对新冠肺炎病人尿样进行研究的论文，揭示了在分子水平上，可以将新冠肺炎的病理过程分为2个阶段，为后续的基础医学研究和临床治疗，提高了理论支持(1)。

中文标题：COVID-19疾病早期的免疫抑制

英文标题：Immune suppression in the early stage of COVID-19 disease

研究对象：新冠肺炎病人

发表期刊：Nature Communications

影响因子：12.121

发表时间：2020.11.17

运用生物技术：DIA-PASEF技术(TimsTOF Pro质谱仪)

在该论文中，黄超兰课题组展示了完整的基于timsTOF pro质谱仪的4D-DIA定量蛋白质组学工作流程，其数据采集基于平行累积连续碎裂技术（parallel accumulation–serial fragmentation, PASEF）和建立在PASEF技术上的数据非依赖型采集（Data Independent Acquisition, DIA）。

具体流程如下，来自健康人群、新冠肺炎患者、普通肺炎患者（非新冠肺炎）的尿样（起始量200μL）经过样品处理并提取酶解后的多肽，2/3的多肽经由反相色谱柱进行脱盐纯化，最终形成32个馏分。搜集的馏分在掺入iRT标准品（用于校正色谱保留时间）后，通过timsTOF Pro质谱仪进行分析。一部分样品首先进行基于DDA模型的数据采集，用于建立图谱库（spectra library），随后剩余样品进行DIA模式数据采集，与常规DIA模式仅仅基于m/z窗口进行扫描不同，DIA-PASEF在窗口选择上，除了考虑m/z窗口外，还增加了碰撞截面积的窗口，使离子选择更有效率。随后数据通过Spectronaut软件进行DDA搜库和DIA分析(图1) 。

图1 | 基本工作流程

在总共37例样本中，共鉴定5991个蛋白质，其中1986个蛋白质通过统计学方法判断为差异蛋白质。

这些蛋白质经过通过生物学通路分析后，富集在近10种生物学通路中，其中包括免疫相关通路（immune-related pathways），紧密连接通路（tight junction pathways）和代谢通路（metabolic pathways）。其中值得关注是免疫相关通路，在新冠肺炎患者的尿液中，（4D-DIA蛋白质组学）显示出大量与免疫相关的蛋白质出现明显的下降，这种现象提示了在新冠肺炎患者体内，免疫应答被抑制。

为了进一步研究新冠肺炎的病理过程，14例新冠肺炎样本根据症状轻重又细分为轻症（moderate）和重症（severe），在PCA分析中，轻症患者和重症患者可以获得良好的区分。基于该基础，对轻者患者和重症患者的差异蛋白质进行富集分析，发现大量的上调蛋白质富集在免疫应答相关的通路中，例如在补体和凝血级联反应（complement and coagulation cascades），自然杀伤细胞介导的细胞毒性(natural killer cell-mediated cytotoxicity)等。

这种现象提示在重症患者中，免疫应答又重新被激活，这与最初的假设不同，因此，可以将新冠肺炎的病理过程分为2个阶段，在发病的早期阶段，免疫应答被抑制，而在发病的后期阶段，免疫应答被重新激活，而从产生细胞因子风暴（图2）。实验中鉴定出2种蛋白质（immunoglobulin lambda variable 3–25和elongation factor 1-alpha 1），可以作为区分2种阶段的标志物，这为临床治疗和进一步病理学研究提供了基础。

图2 | 新冠肺炎的病例过程，可分为2个阶段

在最后的讨论中，作者指出尿液中蛋白质大部分来自血浆蛋白质（经过肾小球过滤），因此尿液蛋白质可以反映人体的健康状况。与血浆蛋白质研究类似，尿液蛋白质的研究也面临着检测灵敏度，动态范围等挑战。作者在实验中，使用了PASEF采集模式以追求高灵敏度；为了保证实验结果的稳定性，又采取了DIA-PASEF采集模式。由此保证了实验结果的灵敏度和稳定性，为进一步的生物信息学分析提供了实验基础。