Nat Comm | 李贵登团队等多家课题组用单细胞蛋白质组学和代谢组学揭示黑色素瘤耐药进化轨迹

2020年5月，苏州系统医学研究所李贵登课题组、加州理工学院的David Baltimore课题组和西雅图系统医学研究院的James Heath课题组在综合性一区期刊Nat Communications（IF:12.121）发表的“Multi-omic single-cell snapshots reveal multiple independent trajectories to drug tolerance in a melanoma cell line”的文章，通过单细胞蛋白质组学和单细胞代谢组学揭示了黑色素瘤细胞早期在药物反应和药物耐受两种状态之间变化的轨迹。研究发现细胞在初始药物反应状态和药物耐受状态之间存在两条完全不同的路径，并且通过实验和理论都证实了这一发现。这一研究成果在很大程度上加深了我们对肿瘤细胞耐药性转化的了解，也为以后设计更加有效的肿瘤联合疗法提供了新的指导。

通过细胞高维状态来确定单细胞的变化轨迹，对于理解从细胞分化到染病细胞在药物作用下的表观遗传等生物学变化是一个巨大的挑战。作者通过数据预测和实验来确定BRAF^V600E突变的单个黑色素瘤细胞从药物敏感状态到药物耐受状态的变化轨迹。尽管通过单细胞组学可以获得某一时刻下细胞的状态情况，但是单细胞变化的轨迹可能被随机的细胞状态切换所混淆。作者在药物治疗的5天内分析了信号通路、表型和代谢调节因子，发现有两条通路连接药物敏感状态和药物耐受状态，且每个轨迹都显示出独特的药物敏感性，更新了等基因细胞群中耐药性的发展方式。

1.BRAFi处理后的单细胞蛋白质组学和单细胞代谢组学分析

使用单细胞Barcode芯片（SCBC）对用BRARi培养5天内的BRAF^V600E突变细胞M397进行蛋白质（定制蛋白质芯片）以及葡萄糖检测，来确定单个黑色素瘤细胞的耐药性（图1a）。

对细胞进行0、1、3和5天（D0为对照组，D1、D3、D5为实验组）药物治疗后，将单个细胞分离到SCBC中纳升体积的微室内。将每个分离的细胞原位裂解，从而释放其细胞内容物。SCBC中的每个微室都包含一套完整的Barcode阵列，每个Barcode要么是蛋白的特异性抗体，要么是用于检测特定代谢物的分子探针（图1a）。研究者收集了各种癌细胞水平的蛋白和代谢标志物，用于单细胞Barcode芯片的定制。

与用药物治疗D0天对比，药物处理不同天数后，某些被检测物质在单细胞水平上存在高度变化（图1b，c）。如黑色素瘤细胞转录因子MITF、代谢调节因子HIF1α和p-AMPKα、增殖标记Ki67、葡萄糖等。在药物治疗初期（D1），葡萄糖摄入、大多数代谢调节因子、磷酸化蛋白、Ki67被抑制，这些物质的抑制反应了BRAFi对关键致癌信号通路的抑制作用。（药物治疗的其它天数，也存在检测物质的特异性变化。）

图1 | 药物处理M397细胞不同时长后单细胞蛋白质组学和单细胞代谢物组学分析

2. 降维分析发现药物处理后从药物敏感状态到耐药状态的多重路径

利用三种降维的算法（FLOW-MAP47、t-SNE48和PHATE49）可视化BRAFi处理不同时长后多个物质在单细胞水平的变化。可视化图形显示黑色素瘤细胞根据药物处理时长进行聚集（图2），显示除了细胞状态的时间轨迹。细胞在第0天和第1天/3天到第5天的耐药性上存在分岔，也说明从药物敏感状态到药物耐受状态存在两条通路的可能性。

图2 | 单细胞蛋白组和单细胞代谢组学整合数据的可视化

3.Surprisal分析揭示了不同路径的被检测物聚集模块

为了进一步剖析药物耐药性的分子变化轨迹，将Surprisal分析应用于本次单细胞数据集，并确定了两个主要模块，每个模块代表一组被检测物质。单细胞中模块的影响分数表示模块关联分析物在该细胞中富集或抑制的程度，通过对流程图中的每个节点上模块1和模块2的影响分数进行颜色编码，将其可视化（图3a）。作者发现模块1的影响分数在上下两条路径上都从负（蓝色）逐渐增加到正（红色），并且在中间时间点有明显的正负变化（图3a-左图）。模块2的影响分数投射到流程图上时，也有相同的变化，这表示存在一个生物物理屏障将上下路径分隔开（图3a-右图）。

值得注意的是，黑色素瘤细胞表型转录因子MITF及其下游蛋白MART1的表达均与模块2评分呈负相关（图3b），这表明两条路径的分岔可能这两种蛋白有密切关系。

图3 | Surprisal分析表明MITF是路径发生分岔的关键转录因子

4.路径分岔的实验验证

Surprisal分析预测从药物敏感状态到耐受状态存在上下两个路径。然后需要实验来验证单细胞是沿着单个轨迹进行两种状态的转换还是会随机地在多个路径之间切换。实验结果显示，MITF-高表达细胞显示出较高水平的Ki67和MITF丰度，并且与MITF-低表达亚群相比，有更短的倍增时间（图3c-f）。 

为了量化药物治疗期间MITF-高表达和MITF-低表达细胞之间随机相互转化的频率，作者在BRAFi治疗的5天内检测大量单细胞内的MITF活性。如预期一样，MITF-高表达细胞中的MITF活性显示出比MITF-低表达细胞更高的活性（图3g），没有观察到两个轨迹之间进行明显的随机切换。

为了进一步确认在给药5天后，分类的细胞各自达到的状态，作者量化了给药第5天后上下通路之间差异表达的被检测物质。对单细胞数据集的挖掘解释了包括Slug、MITF、MART1和PFK在内的多个被检测物，给药5天后，在两条路径（模块2的正值和负值）之间出现差异表达（图3h）。

通过分析Slug、MITF、MART1和PFK这4个基因在药物处理5天后，在MITF-高表达细胞和MITF-低表达-第0天细胞中的表达情况，作者发现治疗5天后，4个基因在MITF-低表达细胞中的表达水平显著低于MITF-高表达细胞（图3i）。

5.临界点分析确定了轨迹分岔调节物质

作者对单细胞数据集的Surprisal分析表明，在D1-D3时间窗口（图3，左图）中，上下通路都具有细胞状态转换的特征。

为了识别上下两条通路上的每个临界点，作者首先在流程图上将所有时间点的单细胞数据聚集成14个不同的子簇（图4a）。每一个集群代表一个过渡的中间状态，簇1、6、7、8、10、11和12位于上通路，而簇2、3、9、13和14位于下通路。

利用信号网络活动指数（SANI）和临界转移指数（Ic）来预测高维状态下的临界转变情况。作者发现上通路中的Cluster 7和Cluster 9在各自路径中有最高SANI值（图4b，c）。这表明Cluster 7和Cluster 9最接近这2条路径上的临界点。

通过对Cluster 7和Cluster 9的临界点进行网络分析，发现这两个集群的网络具有不同的结构特征（图4d，e），这意味着这两个集群以不同的方式调节细胞群的跃迁。网络中的中枢调节物质，可能就是潜在的药物靶点。在Cluster7（上通路），通过两种评分指标，发现一些转录因子和代谢酶，包括MITF、PFK、p-LKB、PKM2、LDH2和Slug，在网络中显示出较高的连接性（图4f）。对于Cluter 9（下通路），TNFR、N-cadherin和p-NFκB-p65在网络中表现出高连接性（图4f）。一个有趣的观察是，在Cluster 7中得分高的物质在Cluster 9中得分低，反之亦然，这表明这两条路径受到不同的调节。

图4 | 两条轨迹的临界点分析与网络分析

6.确定干扰两条路径的物质

为了检验两条路径上的改变是否由不同的调节物质驱动，作者选择了两种专门针对PKM2或NF-κB的抑制剂来分别干扰Cluster 7和Cluster 9。用PKM2抑制剂（PKM2i）或NFκB抑制剂（NFκBi）联合BRAFi治疗分选的MITF-高表达细胞和MITF-低表达细胞亚群。与作者的假设一致，MITF-低表达细胞亚群对BRAFi+NF-κBi组合更敏感（图5a），而MITF-高表达细胞亚群对BRAFi+PKM2i组合更敏感（图5b）。在敲除MITF基因的M398细胞系上进行相同药物组合的检测，结果也同样验证了作者的假设（图5c，d）。说明，沿着不同轨迹的细胞对PKM2和NF-κB的抑制表现出不同的敏感性。

考虑到这两条轨迹的调节依赖性差异，作者进一步假设，通过同时抑制PKM2和NF-κB信号传导来共同阻断这两条轨迹，可能在阻止向BRAFi耐受的转变方面表现出相加效应。为了验证这一假设，作者使用三种药物组合（BRAFi+PKM2i+NF-κBi）在体外治疗M397细胞5天，并将得到的细胞数与单药（仅BRAFi）和双药组合（BRAFi+PKM2i和BRAFi+NF-κBi）治疗5天的细胞数进行比较。与作者的预测一致，三种药物组合明显优于两种药物组合，而两种药物组合又优于单一疗法（图5e）。这意味着这些药物可能通过选择性地阻断BRAFi诱导的细胞状态向药物耐受状态的转变而发挥作用。这些结果表明，上下通路是独立的，具有不同的调节物质，有各自对应的药物可以阻断通路。

图5 | 细胞中与两条轨迹相关的药物敏感性差异

这项研究通过单细胞蛋白质组学和代谢组学解析了药物耐药的异质性反应轨迹，更新了目前对耐药性发展的认识，为确认有效的治疗组合提供了强有力的方法学。

李贵登教授介绍

李贵登研究员本科毕业于厦门大学，并于2012年在加州大学尔湾分校获得博士学位。之后加入诺贝尔奖获得者David Baltimore在加州理工学院的实验室进行博士后研究。课题组研究方向：建立TCR抗原靶点筛选平台筛选鉴定潜在肿瘤治疗新靶点；研究感染，肿瘤和自身免疫疾病中抗原特异性T细胞的反应；探究肿瘤微环境对免疫治疗耐药的机制。

参考文献：

Su Y , Ko M E , Cheng H , et al. Multi-omic single-cell snapshots reveal multiple independent trajectories to drug tolerance in a melanoma cell line[J]. Nature Communications, 2020.

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貔貅 撰文

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