Cancer Cell重大突破 | 我国科学家首次获得了转移性大肠癌的综合组学数据，为精准治疗奠定了基础

前言

2020年11月中国科学院上海生化细胞所吴家睿，曾嵘团队及海军医科大学张卫团队合作在Cancer Cell发表题为“Integrated Omics of Metastatic Colorectal Cancer”的研究成果，通过蛋白质组学技术发现结直肠癌可分为三种亚型，每种亚型具有不同的临床预后和分子特征。进一步结合磷酸化蛋白质组学，可以成功的区分转移病例。药敏实验发现激酶-底物网络分析可有效预测药物响应。本研究为更好地了解转移性结直肠癌提供了宝贵的资源，有助于临床个体化医疗。

研究背景

结直肠癌（CRC）是全球第四大致命癌症，每年有近90万人死亡。衰老、不良饮食和生活方式都会增加患CRC的风险。CRC表现出高度异质性，分子水平的不同亚型在预后上存在差异。在治疗方面，尽管取得了越来越多的进展，但CRC的死亡率，尤其是转移性CRC的死亡率仍然很高。目前，只有DNA错配修复状态、RAS突变和BRAF突变状态影响临床决策。而多组学研究可能会实现精准医疗从而有助于治疗并改善预后。先前TCGA和CPTAC结直肠癌队列的研究具有多组学特征并展现出了分子异质性。然而这些研究更多关注非亚洲人群的非转移状态。本文作者介绍了中国人群转移性结直肠癌基因组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的整合多组学研究。

研究思路

研究结果

1.研究概述

本文应用多组学方法对146例中国结直肠癌患者（CCRC）进行分析，包括70例转移性结直肠癌（mCRC）患者和76例早期非转移性结直肠癌（non-mCRC）患者。从每位患者身上获取原发肿瘤组织（T）、远处正常组织（N）、癌旁组织（P）和匹配的外周血细胞（BC）。对于mCRC，还研究了43个可用的远处肝转移组织（LM）（样本策略）。作者对330个样本进行了全外显子组测序（WES），并使用DIA（data-independent acquisition）技术产生480个样本的蛋白质组和磷酸化蛋白质组数据，共得到8,450种蛋白的定量结果和47,786个磷酸化位点的定量结果。这些患者的平均随访时间为1240天。

2.中国CRC患者基因突变情况

在146名CRC患者的原发性肿瘤中，与癌症相关频率最高的突变是APC（突变频率为65％），TP53（64％）和KRAS（32％）（图1A）。与TCGA CRC数据集相比，CCRC的mCRC患者比例更高（图1B）。此外CCRC在三个队列中的直肠癌病例所占比例最高（图1B）。作者发现与其他两个队列相比，CCRC中的APC突变频率显著降低。此外CCRC中BRAF和PTEN突变的频率也显著低于西方数据集（图1C）。

为了鉴定与转移相关的基因，作者比较了来自CCRC队列的非转移CRC和mCRC基因组改变的频率。与非转移CRC相比，mCRC原发肿瘤的突变负荷低（图1D）。在CRC突变频繁最高基因中（图1C），只有SMAD4在mCRC患者的原发性肿瘤中的突变率显著更高；XIRP2在mCRC患者的原发肿瘤中也高度富集（图1E）。与非mCRC患者相比，mCRC患者的原发性肿瘤表现出更多的多克隆结构（图1F），表明mCRC在肿瘤中转移的可能性。

图1 | 中国CRC患者基因突变概况

3.基于蛋白质组数据的亚型分类

作者运用蛋白质组学对原发性肿瘤和正常组织之间的2,440种差异蛋白进行了一致性聚类，得到三个聚类cluster（CC）（图2A）。CC1的特征是增加的RNA加工和DNA错配修复（MMR）。CC2中上调的蛋白质富含细胞外基质-受体整合通路和免疫相关通路。CC3富含上调的DNA复制和代谢通路。三种亚型的无病生存率不同（图2B），多因素分析表明亚型是一个独立的预后因素。此外在转移性结直肠癌患者中，CC3亚型的mCRC患者也显示出最差的无病生存率（图2C）。

接着作者在这三种亚型中鉴定了差异突变基因或体细胞拷贝数变化（SCNA）（图2D），发现突变显著富集于CC3亚型和直肠癌中（图2E）。然后作者检查了295个差异SCNA基因和蛋白质丰度的相关性（图2D）。与CC1和CC2相比，大多数SCNA基因在CC3中表现出更多的缺失，而其蛋白质丰度在CC3中更高。这些基因在氧化磷酸化，RNA剪接，嗜中性粒细胞脱粒以及与选择性剪接相关的通路中显著富集。CC2中的下调蛋白质富集在DNA MMR通路（图2A），但与微卫星不稳定性（MSI）状态（图2A）没有明显关联。与其他亚型相比，PCNA，RFC1，RFC3，RFC4和SSBP1 MMR通路蛋白在CC2中显著下调（图2F）。为了进一步探索驱动MMR的机制，作者选取了32个样本进行甲基化实验，发现RFC3和SSBP1的甲基化水平与其编码蛋白的表达呈显著负相关（图2F）。这些结果表明，CC2亚型具有与蛋白质模式相关的独特且非规范的表观遗传特征。

本文中的蛋白质组学数据亚型与CPTAC蛋白质组和CMS分类整体一致（图2G）。其中CC1与包含CMS1和CMS3的CPTAC亚型A和E相匹配，并且预后较好；CC2与亚型C和CMS4相似（图2G），由于带有间充质特征的ECM富集，其预后通常比CC1（图2A和2B）差；CC3对应于CPTAC亚型B，但与CPTAC亚型B不同的是CC3中没有MSI的富集，CC3的无病生存率最差（图2B），说明了该亚型的复杂性。这些结果可能与CCRC队列中的转移患者比例过高有关（图1B）。

图2 | CCRC的蛋白质组学分型及每种亚型的临床意义

4.磷酸化蛋白质组学区分非转移CRC和转移性CRC

蛋白质组亚型中未观察到mCRC或非mCRC患者的富集（图2A）。而通过T和N的差异磷酸化位点进行一致性聚类在蛋白质组亚型的基础上进一步做子亚型，得到六种磷酸化蛋白质组学亚型的分类（图3A和3B），则可区分mCRC和非mCRC。SC1，SC3和SC5富含mCRC患者，而SC2，SC4和SC6是非转移性CRC的特征。

功能富集分析发现在SC1，SC3和SC5中高表达的磷酸化蛋白在focal adhesion和adherens junction通路中富集（图3C）。相反，在SC2，SC4和SC6中上调的磷酸化位点在亚型之间显示出更多的功能相似性，并富含ERBB2信号传导，子宫内膜癌，抗原加工和呈递以及FcγR介导的吞噬作用通路（图3C）。基于PhosphoSitePlus数据库的激酶与底物的关系，作者发现SC1，SC3和SC5中的激酶与磷酸化位点之间大多呈负相关，而SC2和SC4中的正相关则较多（图3D）。SC6的特征在于激酶和底物之间的负调控，这表明CC3中的非mCRC更像是预后较差的mCRC（图3E）。

图3 | CCRC的磷酸化蛋白质图谱

5.转移性肿瘤的蛋白基因组特征

对于mCRC，无论MSI状态如何，在原发灶和转移灶中均观察到突变谱之间的高度一致性（图4A和4B）。尽管原发灶肿瘤倾向于具有更多独特的突变，但驱动基因和先前研究的转移关键基因的突变都没有明显差异（图4C）。此外，突变频率最高的SCNA在原发灶和转移灶之间没有差异（图4D），而转移性mCRC肿瘤与原发性肿瘤相比有更多的单克隆比例（图4E）。这些结果表明转移性肿瘤源自原发性肿瘤或相同的祖先克隆。

但是，转移性肿瘤的蛋白质组与原发性肿瘤相比有明显差异。转移性肿瘤与正常组织相比有更多的上调蛋白质（图4F），这些差异蛋白可明显的区分转移组织与原发组织（图4G）。在转移性肿瘤中上调的蛋白质与ECM受体相互作用、药物代谢、黏着斑（focal adhesion）和紧密连接（tight junction）相关（图4H），而在转移性肿瘤中下调的蛋白质则富含代谢通路，脂肪酸降解，柠檬酸盐循环和氧化磷酸化（图4H）。

图4 | mCRC的蛋白基因组特征

6.mCRC患者多个组织中的磷酸化位点-蛋白质的共同变化

接着作者运用磷酸化蛋白质组学关注42例有四种组织类型（N，P，T和LM）的mCRC患者，属于CC1，CC2和CC3亚型的患者有10、21和11个。作者计算了四种组织间磷酸位点丰度与蛋白质丰度的皮尔森相关系数，并使用ANOVA鉴定了954种在三个亚型间存在差异的磷酸化位点-蛋白质对。这954对磷酸化位点-蛋白质的相关性可以区分这三种蛋白质组学亚型（图5A），并且954对磷酸化位点与蛋白质的关系可以分为三个cluster：CC1neg，CC2neg和CC3neg。使用MCODE分析方法，作者发现了五个关键的共同变化的磷酸化位点-蛋白质MCODEs，包括112个结点和355个边（图5B）。其中TP53（图5C）和LKB1通路（图5E）的转录调控分别是CC1neg和CC3neg最主要特异性MCODE。相反，mRNA剪接复合体是CC2neg最主要的MCODE（图5D）。四个激酶PRKCD，MAPK1，MTOR和PRKAA1的七个位点在CC3neg的MCODE 1细胞凋亡中（图5A），PRKCD-S304或MTOR-S1166与它们相应的蛋白质之间的相关性在每个亚型中是不同的，并且它们在三个亚型之间都显示出不同的蛋白质或磷酸化位点表达谱（图5F）。这些结果表明患者多个组织之间的磷酸化位点-蛋白质关系显示出与蛋白质亚型相关的独特特征。

图5 | mCRC患者多个组织中的磷酸化位点-蛋白质的共同变化

7.磷酸化蛋白质组为mCRC患者鉴定药靶

作者使用底物富集分析发现不同的亚型富含不同的激酶，并且同一激酶在原发灶和转移灶中表现出不同的活性（图6A）。对于具有可定量蛋白质水平的激酶和临床上可应用的药物，作者分析了mCRC的42个配对N-T或N-LM组织中相应的磷酸底物丰度（图6B和6C），共发现251对激酶-磷酸底物。在mCRC患者的不同组织和蛋白质组学亚型中观察到了磷酸底物和激酶的高度异质性（图6B）。

接着作者基于激酶-磷酸底物之间的皮尔逊相关系数，为每种蛋白质组亚型的原发性和转移性肿瘤构建激酶-底物网络（图6C）。例如CC1转移性肿瘤中观察到CDK4及其底物之间存在正相关，而在CC1原发性肿瘤中未发现显著相关（图6C）。此外CC3网络与CC1网络的相似性大于与CC2网络的相似性（图6D）。亚组内原发性和转移性肿瘤之间激酶-磷酸底物网络的差异也大于亚型间原发性肿瘤的差异。

图6 | 磷酸底物与相应激酶的富集

为了进一步探索mCRC患者的药物响应潜力，作者在31种miniPDX模型中构建了三种激酶抑制剂（阿法替尼，吉非替尼和雷戈非尼）的药理学测试（图7A）。通过肿瘤细胞生长抑制（TCGI，％）测量了每种肿瘤对每种药物的药物响应效果（图7B），发现来自同一个体的原发灶和转移灶肿瘤对相同药物可能表现出不同的反应（图7B）。在31种miniPDX肿瘤中与三种激酶抑制剂相对应的基因中很少发现突变，因此结果表明磷酸化蛋白质组数据在考察治疗适用性方面可能比突变更灵敏。

最后作者基于激酶-磷酸底物网络构建模型预测药物响应（图7C-E），结果证明了激酶-磷酸底物网络在预测mCRC患者药物敏感性方面具有强大的潜力。

图7 | 激酶-底物网络分析和miniPDX药物测试

研究结论

本文作者整合了来自中国结直肠癌队列中146例患者的480个临床样本的基因组学，蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学。蛋白质组学将CRC分为三种亚型，每种亚型具有不同的临床预后和分子特征。对原发灶的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，可以成功地区分转移病例。转移组织在遗传学上与原发灶表现出高度相似性，但在蛋白质组学水平上却差异较大，并且激酶网络分析显示原发灶肿瘤与其肝转移灶肿瘤之间存在显著的异质性。使用31种原发性和转移性肿瘤的体内异种移植药物测试显示出个性化反应，且可以通过激酶-底物网络分析预测，而这与药物靶标基因是否突变无关。本研究为更好地了解mCRC提供了宝贵的资源，并具有临床应用潜力。

本文基于对转移性和原发性肿瘤之间蛋白质组和磷酸化蛋白质组的分析，发现结合蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学数据的网络分析可以准确反映药物响应。这些结果表明原发灶和转移灶中蛋白质组和磷酸化蛋白质组的检测，有助于制定个性化治疗策略。

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云起 撰文

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