项目文章 | 转录组学+iTRAQ蛋白质组学揭示干旱条件下木薯的转录后调控机理

欧易/鹿明生物合作客户中国植物基因研究中心课题组在Journal of Agricultural and Food Chemistry发表的题为“Extensive Post-Transcriptional Regulation Revealed by Transcriptomic and Proteomic Integrative Analysis in Cassava under Drought ”的研究成果，通过转录组测序技术和iTRAQ标记定量蛋白质组学联合研究，在木薯叶片和根中分别鉴定出1242/715个差异表达基因（DEGs）和237/307个差异表达蛋白（DEPs）。本研究作为木薯转录组学和蛋白质组学分析的首次研究，为干旱胁迫下木薯的转录后调控提供了新的方向。

干旱是世界范围内严重影响植物生长和作物产量的非生物胁迫之一。植物对干旱胁迫具有复杂的调节机制，干旱引起多种生理生化变化。在干旱胁迫下，发现了数以千计的基因和多个调控信号通路参与，其中激素相关基因是干旱调控网络的关键调控因子。除了脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）和油菜素内酯（BR）等与ABA互作的激素也参与了干旱胁迫，除此之外，与ROS信号转导、热休克蛋白（HSPs）、次生代谢和转录因子相关的基因也参与了干旱胁迫响应。

随着全球范围内有关干旱响应的转录组和蛋白质组学研究的增多，越来越多的证据表明转录组与蛋白质组变化常常不一致，表明转录后调控在胁迫条件下的植物响应中起着关键作用，进一步的研究表明，参与干旱胁迫的转录后调控基因与HSPs有关。

木薯具有耐旱性，但严重而持续的干旱胁迫极大地抑制了木薯的生长发育，最终降低了其产量。随着高通量测序技术的发展和木薯参考基因组的获得，RNA-seq转录组学和iTRAQ标记定量蛋白质组学已成为研究基因和蛋白质表达变化的重要工具。

1.干旱胁迫下木薯的生理响应

与对照（0h）相比，木薯幼苗叶片在PEG模拟干旱胁迫下3h轻度萎蔫，而在24h严重萎蔫。生理研究表明，PEG处理后24h，叶片脯氨酸含量、丙二醛含量、可溶性蛋白质含量、可溶性糖含量和POD活性显著增加；而在3h时变化不大。这也表明：在PEG处理的24h内，数千个基因在叶和根的转录水平上发生了显著的变化。

2.干旱条件下木薯叶和根的转录组分析

随机选取FPKM>1作为检测样本间表达基因的阈值。总共有24276个表达基因（包括分别来自叶和根的20531和22508个基因），相当于木薯基因组注释基因的74%。为了验证转录组测序数据的表达结果，采用qRT-PCR方法检测了15个与ROS清除、激素代谢、热休克蛋白和转录因子有关的基因。这两种实验放大的结果之间的相关系数较高（R=0.71-0.98），说明RNA-seq检测的基因表达谱是可靠的。

3.木薯叶和根中的DEGs

与对照相比，干旱胁迫下的叶片和根系中分别鉴定出1242和715差异基因。大多数DEGs只存在于叶片或者根系中，而只有少数DEGs是广泛存在的（图1A），这表明干旱条件下叶片和根系的不同功能途径分别受到影响。

为了揭示PEG处理对功能途径的影响，将这些DEGs分为上调和下调两组，分别对各组进行功能分类富集实验。叶片中有503个上调和739个下调DEGs。根中有178个上调和537个下调的DEGs。这些结果在转录水平上提供了干旱胁迫对木薯功能途径具有影响。

图1 | 显示DEG和DEP数量的维恩图

4.干旱条件下木薯叶片和根系的蛋白质组分析

通过iTRAQ蛋白质组学研究叶和根样品共检测到53650和87104个多肽，分别检测到5900和9440个蛋白质。共有6152个非冗余蛋白（占基因组注释蛋白的18.7%）被定性和定量。

5.木薯叶和根中的DEPs

在叶片中发现138个上调和99个下调的DEPs（图1B）。根中有162个上调和145个下调的DEPs。与转录组分析的结果相似，在叶和根样本中变化相同的差异蛋白极少（图1B），说明干旱胁迫对叶和根中的不同功能途径起作用。这些结果在蛋白质组水平上提供了干旱胁迫对木薯功能途径影响解析。

6.mRNA与蛋白质谱的相关性

在转录组学和iTRAQ蛋白质组学数据之间进行相关分析。在6152个定量蛋白中，有5763个被检测到（FPKM>5）。相关分析显示，在叶片和根中，所有定量蛋白的表达水平与其对应的mRNAs之间的相关系数较低。然而，在叶片和根系中，DEPs与相应的mRNAs之间的相关性高出约2倍（图2），表明蛋白质和mRNA在干旱胁迫中的变化具有一定的生物学相关性。

在叶和根中分别鉴定出1242和715DEGs以及237和307DEPs。在这些DEGs和DEPs中，只有61和42个在干旱胁迫下的mRNA和蛋白质水平上，分别在叶片和根系中被统一调控。其中57和31个蛋白的表达变化趋势相同，说明这些蛋白的表达变化主要受转录变化的控制。但也有一些基因在mRNA和蛋白质水平上呈相反的变化趋势，表明这些基因/蛋白质的转录后调节参与其中。因此，蛋白质组学和转录组学的联合分析将为木薯干旱反应相关机理的研究提供更多的信息。

图2 | 叶片（A）和根（B）中蛋白质和mRNAs表达的相关性

7.叶片蛋白质组和转录组的联合分析

通过比较DEGs和DEPs，在mRNA和蛋白质水平上，叶片中有49个上调基因和8个下调基因的变化趋势相同。叶片中，有454个上调和731个下调的DEGs，其相应的蛋白质没有差异表达（图2C）。与功能富集结果一致，干旱极大地诱导了棉子糖代谢相关基因的表达、ABA代谢相关基因的表达、非生物胁迫基因的表达。这些基因大多与热应激有关。

相反，干旱严重抑制了卡尔文循环相关基因的表达，光信号传导相关基因，淀粉生物合成基因AGPase、SS、SPS、SPP，海藻糖生物合成途径的TPPs、TPS等有关的基因。叶片中，有89个上调和91个下调的DEPs，其相应的基因没有表达差异（图1C）。干旱显著诱导了参与光合作用的蛋白质、糖酵解过程中参与ROS信号传导的蛋白、氧化还原相关蛋白的表达。

8.根中蛋白质组学和转录组学的联合分析

在转录组和蛋白质组水平上，有25个上调基因和6个下调基因在根中的变化趋势相同（图2D）。这些上调基因在AA合成代谢、糖异生/乙醛酸循环和非生物胁迫中显著富集。这些上调基因中有8个（32%）属于HSPs。4个热休克蛋白和2个ROS清除基因（APX2和GSTU19）在木薯叶片和根系中普遍上调，表明它们在木薯干旱反应中的关键作用。共有4个AA代谢基因表达上调。此外，与乙醛酸循环（AAE7）、ABA刺激（GLP5）等相关的基因也上调。相反，这些下调的基因在纤维素合成（如CSLA09）和过氧化物酶代谢（如PRXR1）中显著富集。

在转录组学水平上，有153个上调和531个下调的DEGs发生显著变化。干旱显著抑制了JA信号转导和JA生物合成基因的表达，这些基因翻译了JA生物合成途径上的所有酶。干旱严重抑制了一些与BR生物合成相关的基因，ABA生物合成的一些基因，与激素相关的受体激酶信号基因，钙信号传导相关基因等。

有137个上调和139个下调的DEPs，其相应的基因没有表达差异（图1D）。在41个与非生物胁迫相关的DEPs中，39个被显著诱导，其中大多数（92%）是HSPs，强烈提示HSPs在蛋白质水平上是对干旱的响应。根据功能富集结果，对参与14-3-3蛋白（GRF1和GRF2）信号传导和TCA/org转化（NADP-ME3和IDHIII）的蛋白进行了诱导。相反，干旱显著抑制了硝酸盐转运（NRT2.4）和磷酸盐转运（PHT1;5和PHT1;7）相关蛋白的表达。干旱还显著抑制了与细胞分裂（FIS1B和clap）、细胞组织（OBE2）和细胞囊泡转运（VTI1B和SYP32）相关的蛋白质。此外，一些对非生物胁迫有反应的蛋白质（如ANNAT3、TUB6、YLS5和PIP2）和ROS清除（CSD1）也受到抑制。最后，通过RNA-seq和iTRAQ综合分析，干旱胁迫显著影响了这些途径，如图3所示。

图3 | 通过RNA-seq和iTRAQ联合分析

此研究采用转录组测序和iTRAQ标记定量蛋白质组学技术，分别分析了干旱处理与对照下的木薯叶片和根系的差异表达基因（DEGs）和差异表达蛋白（DEPs）。本研究拓展了对转录后调控参与木薯抗旱反应的认识，也为木薯抗旱改良品种的选育提供了候选材料。

木薯是一种重要的热带/亚热带粮食作物，其产量受到干旱的严重制约。本研究采用转录组测序和iTRAQ蛋白质组学技术。在木薯叶片和根中分别鉴定出1242/715个差异表达基因（DEGs）和237/307个差异表达蛋白（DEPs）。DEGs和DEPs主要在mRNA和蛋白质水平上单独调控，只有少数在干旱条件下被普遍调控，说明它们主要参与转录后调控。随后，分析了这些特异或共同调控的DEGs和DEPs的功能，并对热休克蛋白、次生代谢生物合成和激素生物合成相关基因的转录后调控进行了分析。本研究作为木薯转录组学和蛋白质组学分析的首次研究，为干旱胁迫下木薯的转录后调控提供了新的方向。

参考文献：

Ding, Z., Fu, L., Tie, W., et al. Extensive Post-Transcriptional Regulation Revealed by Transcriptomic and Proteomic Integrative Analysis in Cassava under Drought[J]. Journal of agricultural and food chemistry, 2019, 67:3521-3534.

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