荧光偏振技术快速检测生物分子的结合试验——布鲁氏菌病的兽医诊断

荧光偏振的实验原理及计算公式

（I|| =水平荧光强度，I⊥ =垂直荧光强度）

使用布鲁氏菌S抗体检测试剂盒，

FPA（ellie）基于荧光偏振法

快速检测流产布鲁氏菌特异性抗体。

布鲁氏杆菌（Brucella）是一种革兰氏阴性的不运动细菌。1886年，苏格兰病理学家和微生物学家大卫.布鲁氏（David Bruce），在地中海岛国马耳他担任军医时，从死于“马耳他热”的士兵脾脏中首次确认并分离出了该细菌。后来的学者们为了纪念布鲁氏，就将这种细菌命名为布鲁氏杆菌。此菌会引起布鲁氏菌病，简称布病，它是一种人畜共患的慢性传染性疾病，除了引发严重的公共卫生威胁外，还在全世界范围造成重大经济损失^[1]。

在我国布病的主要传染源为牛、羊、猪 3 种牲畜，反刍动物的布鲁氏菌病具有高度传染性，会导致新近感染的动物流产或过早产犊。

1926年Perrin首次在研究中描述他所观察到的荧光偏振现象。如果被激发的荧光物质处于静止状态，该物质仍保持原有激发光的偏振性；如果被激发的荧光物质处于运动状态，该物质发出的偏振光将区别于原有激发光的偏振性，即荧光去偏振现象^[2]。

荧光偏振（FP）的测量通过两个不同的偏振滤光片进行，这两个偏振滤光片分别平行和垂直于偏振激发光的平面。任何荧光团复合物的偏振值与该复合物的分子旋转速度成反比。由于旋转速度也与分子的大小成反比，因此大分子复合物的偏振值高，小分子的偏振值较低。通过平行和垂直滤光片监测发射光的荧光强度。发射光强度从平行到垂直的的转移程度与荧光分子的旋转速度成比例。如果分子非常大，则在激发期间几乎没有移动，因此从平行转移到垂直的信号很少。然而，如果荧光分子很小，则旋转速度很快，导致信号从平行到垂直有更大程度的转移。偏振程度的保持取决于被测分子的大小：分子越大，则旋转慢，因而越能保持原始的偏振性。其他影响因素包括溶剂粘度、温度和分子处于激发态的寿命。

Tecan酶标仪Magellan™关于偏振值的计算，仪器检测后自动得出RFU||，RFU⊥，BL||，BL⊥的荧光信号值^[3-4]，分别代表：

布鲁氏菌S 抗体检测试剂盒来自ellie（产品货号B1001）。根据试剂盒说明书测量阳性对照（PC）和阴性对照（NC）。首先，取3份20μL NC和1份20μL PC加入96孔微孔板，每孔对照加180μL 试剂缓冲液并孵育5分钟。然后向所有孔中加入10μL 荧光示踪剂并孵育5分钟后测定荧光偏振值。

使用Infinite Fplex测定样品的偏振值。使用激发485/20 和发射530/25 的滤光片组获得平行和垂直偏振荧光信号。设定PMT 增益值，使得原始平行光测量值约为25000-30000RFU。使用 Magellan™数据分析软件控制仪器读数并使用 G 因子，Tecan Brucella FPA 给用户提供两种方法:

两步法流程：（其他酶标仪提供商），准备阴阳对照，均测两次FP，第一次FP为空白（Blank,简称B），仅有阴阳对照液和稀释液；第二次FP为加入tracer后检测的结果（L2）。阴性和阳性对照各设置3个重复，G因子采用Calibrate方式，设置tracer为RF，稀释液为Blank。

一步法流程（Tecan）：准备阴阳对照和空白对照（同体积的稀释液，不加tracer），阴阳对照加入tracer后检测FP。阴性和阳性对照各设置3个重复，G因子采用calibrate 或者manual设置。

软件直接算出荧光偏振(mP)，根据mP值在Megellan中进行数据转换，得到Delta mP。

当G-factor为1时，阴性对照与阳性对照的mP均在说明书规定有效范围内。阴性对照mP的变异系数（CV）为3%，说明重复性很好。

图1  布鲁氏菌阴/阳对照偏振值比较

由图1所示，Fplex两步法阴性对照均值为76mP，阳性对照平均值为203mP，窗口为130；一步法阴性对照均值为79mP，阳性对照平均值为206mP，窗口为130。

此实验检测腔温度为18.5℃，低于室温，仪器升温至30℃，再放入微孔板检测。结果显示阴性对照均值为78mP，阳性对照平均值为213mP，窗口为138。

使用美国elie公司的Sentry 200便携式荧光偏振仪（无温控），同等条件下检测的结果做对比，其阴性对照均值为89mP，阳性对照均值为220mP，窗口为131。

本实验最终通过Delta mP（样品mP-阴性对照平均mP）分析样品，如果待检样品的mP与阴性对照平均mP的差值＞20代表为阳性；若Delta mP≤10代表阴性，若10＜Delta mP＜20代表可疑。

一般地，示踪剂（荧光标记复合物）的偏振值约为 75-80mP，而纯荧光素小分子的偏振值约为 20mP。该差异反映了荧光素分子与布鲁氏菌的抗原表位 OPS 或肽之间的分子大小差异。测定的有效窗口取决于复合物大小相对变化。如果示踪剂本身是大分子，则抗体的结合只会使偏振值稍许变化。若示踪剂与小分子结合，则偏振的变化极小甚至检测不到。布鲁氏菌检测试剂盒精良的设计，使得当结合发生时，偏振值的变化是显着的。即使当血清中仅存在少量抗体，其优秀的检测窗口也保证了非常高的检测灵敏度。