1、仪器与设备

粉碎机、40目分样筛、分析天平（感量0.1mg）、烧杯250mL、玻璃棒、漏斗(直径10cm)、定性滤纸（中速，12.5cm，15cm)、可控温干燥箱、K1100F全自动凯氏定氮仪、SH420F石墨消解炉、可控温电炉

2、试剂

浓硫酸（98%）、硫酸铜(分析纯)、硫酸铜溶液(10%)、硫酸钾、氢氧化钠溶液（40%）、氢氧化钠溶液（2.5%）、硼酸（20g/L，按混合指示剂：硼酸=1:100加入指示剂）、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂(1:5)、硫酸标准溶液（C（1/2H₂SO₄=0.1011mol/L)、氯化钡溶液（5%）。

1、前处理

将风干饲料样品用饲料样品粉碎机粉碎，通过40目（孔径0.45 mm）筛，制得分析饲料样本，备用。

准确称取约0.5g试样（精确至0.0001 g）置于250 mL烧杯中，加75mL蒸馏水，加热至沸煮沸30min，加入2.5 %氢氧化钠溶液20 mL，10 %硫酸铜溶液20 mL，用玻璃棒充分搅拌均匀，微沸一段时间，冷却放置超过2 h。用定性滤纸过滤，然后用70~80 ℃热水冲洗沉淀5次以上，用 5%氯化钡溶液5滴和数滴盐酸检查滤液，直至不生成白色硫酸钡沉淀。将沉淀和滤纸放在65 ℃烘箱烘干。（共称取9个样品，4-9经上述沉淀处理，8号样品添加0.0636g尿素，9号样品添加0.1135g硫酸铵；1-3号样品不做沉淀处理直接消化）。

2、消解

将干燥后的沉淀连同滤纸一起放入消化管中，加入15mL浓硫酸，3g硫酸钾，0.2g硫酸铜，放在石墨消解炉上设置温度梯度升温消化（同时做空白试验）。

升温程序：

消解完成后，冷却，待上机。

3、测试

将冷却后的消化管置于K1100F全自动凯氏定氮仪上，设置参数：硼酸20mL，碱60mL，稀释水10mL，蒸馏5min。依次做空白及样品，结果自动计算，打印。

1、样品空白消耗滴定酸的体积

2、饲料中粗蛋白的测定

3、饲料中真蛋白测定

4、饲料中添加真蛋白测定

通过3.2与3.3的数据对比可以看出两者相差近2%，除去操作损失基本可以判断饲料中确实含有非蛋白氮成分。8号和9号样品分别添加一定量的尿素、硫酸铵，但是真蛋白含量与其他样相差不大，所以可以验证此方法测定饲料中真蛋白的可行性。

4、结论

通过硫酸铜等重金属盐在碱性环境下是蛋白质变性，过滤掉非蛋白氮成分，再利用凯氏定氮法测定蛋白质含量，操作并不复杂，且结果令人满意，通过添加非蛋白氮（尿素、硫酸铵）成分验证了此方法的适用性，可以用于实际的真蛋白检测中。

注意事项

倾泻法过滤洗涤时，烧杯中的沉淀物一定要彻底清洗。且洗涤时要用80℃左右的热水，可以减少洗涤次数。

沉淀必须要烘干，不可带有大量水分放入消化管消化，否则会过冲，造成实验失败。

在石墨炉上消化时，应设置梯度升温，避免样品直接高温出现过冲现象。