代谢组学分析方法

代谢组学分析方法

代谢组学是目前关注度颇高的组学方向：其一，大家普遍认可代谢物是反映生物表型、状态的最有效分子；其二，代谢物被认为是功能分子、信号分子，其慢慢与功能组相挂钩；其三，肠道微生物等新兴研究热点的带动。

目前用于代谢物组学分析的方法主要有酶分析法、核磁共振NMR、薄层色谱TLC、高效液相HPLC、气相色谱GC、质谱以及质谱连用等技术。

研究植物与微生物长使用质谱检测代谢物，而在动物样品中则更多的采用核磁共振NMR技术。

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代谢组学分析流程

一般来说，代谢组的分析流程有：首先将代谢组分进行预处理， 预处理的方法由测量分析方法决定，如使用质谱方法分析，则需要预先对代谢组分进行分离和离子化。接着，再对预处理后的组分进行定性和定量分析。

预处理中，常用分离方法包括：气相色谱（Gas chromatography， GC），高效液相色谱（High performance liquid chromatography， HPLC）。气相色谱具有较高的分辨率，但需要对代谢组分进行气化，并且对组分分子质量有一定的限制。高效液相色谱也在代谢组分析中被广泛地使用，因其在液相中对代谢组分进行分离，因此不用对组分进行气化，相较气相色谱具有测量范围更广，更灵敏的优点。此外，毛细管电泳法（Capillary electrophoresis）也可以对代谢组分进行分离，其应用较少，但在理论上其分离效率比高效液相色谱法高。

在预处理时，常常会加入内参（internal standards），以方便后续对样品的质量进行监控和对比，由于不同的实验批次、样品顺序对后续测量也有一定对影响，因此，还会加入空对照和混合样品对照来进行质量监控。

对不同的代谢组分进行定性和定量分析的方法包括质谱分析法（Mass spectrometry， MS)和核磁共振谱（Nuclear Magnetic Resonance Imaging， NMR）等。其中，质谱分析法具有灵敏度高，特异性强等优点，被广泛地应用于检测代谢组分，可以对经过分离、离子化处理后的代谢组分进行定性和定量。

离子化的方法包括：大气压化学电离（Atmospheric-pressure chemical ionization， APCI）， 电子电离（Electron ionization， EI )， 以及电喷雾电离（Electrospray ionization ， ESI)等，需要根据不同的分离方法选用。例如电喷雾电离，常用于被液相色谱进行分离的组分。但由于质谱并不能直接对生物溶液或组织进行检测，其应用一直受限。为了提高原有的质谱分析法的灵敏性，使样品的准备简单化，减少背景的影响，一些新的质谱相关技术得以产生。这些技术包括：二次离子质谱（Secondary-ion mass spectrometry ， SIMS)和纳米结构引发器质谱（Nanostructure-Initiator MS， NIMS)，属于去吸附／离子化方法，这两种技术都不依赖基质。其中，SIMS使用高能离子束使样品接触表面解吸，具有高空间分辨率的优势，与质谱串联后是用于器官／组织造影的有力技术。而NIMS可用于小分子的检测。基质辅助激光脱附电离（Matrix-assisted laser desorption/ionization ，MALDI）是一种较为温和的离子化方法，可以得到用常规离子化方法容易解离为碎片的一些完整大分子质谱信息，如DNA、蛋白质、多肽和糖等。解析电喷雾电离（Desorption electrospray ionization ，DESI)是一种直接电离技术，可以与质谱串联后，直接对大气条件下的样品分析。其原理是利用快速移动的带电溶液流来提取接触表面的样品，可用于取证分析、药物、植物、生物组织、高聚物等的分析。激光烧蚀电喷雾电离（Laser Ablation Electrospray Ionization ， LAESI)是一种结合了中红外激光烧蚀和二次电喷雾电离的直接电离技术，可用于广泛的样品，包括植物、组织、细胞，甚至是未经处理的生物溶液如血液、尿液等。已被用于食品监管、药物监管等领域。核磁共振谱不需要预先对代谢组分进行分离，相较质谱而言，核磁共振谱具有结果可重复性好，样品准备较简单，不用预先分离，对样品破坏性低等优点，尽管灵敏性相较质谱低（存在争议，部分学者认为这是样品预处理工作流程不正确造成的），但因其易于使用，因此应用也十分广泛。

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主流分析方法推荐

由于质谱技术的不断完善及其自身的优势、使得这种技术已经称为代谢组学研究的重要手段之一。质谱作为强有力的仪器分析手段，能够提供大量的分子结构信息。目前常用的联用技术是气质联用GC-MS和液质联用LC-MS。

选择LC-MS做讨论的理由有三：

（1）LC-MS平台对代谢物的覆盖最广、灵敏度更高。从文献中已报道的同时使用多种分析平台的数据来看，都是LC-MS获得的数据量显著更多；

（2）相比于GC-MS，LC-MS一般无需衍生处理，分析平行性更好，更适合大规模样本的分析；

（3）使用LC-MS平台的人员和机构更多，包括很多做NMR和GC-MS的代谢组学专家都已转向LC-MS。