Ebio ReaderTM 3700M飞行时间质谱系统鉴别大肠埃希菌和志贺菌应用

从全基因组角度上，大肠埃希氏菌（Escherichiacoli，E.coli）和志贺菌（Shigella Castellani）的平均核苷酸一致率＞95%，保守DNA＞69%，符合同一个种的定义，它们在菌落形态及生物学特性方面都非常相似，因此在临床实验室的常规工作中很容易被混淆，影响疾病的准确治疗。即使是通过16SrRNA测序也只能鉴定到志贺菌-大肠埃希氏菌，并不能将其准确区分，进一步的鉴定需要依赖生化反应及血清学试验，但是这两种鉴定手段的实验步骤复杂、耗时很长，根本无法满足临床上对时效性的要求。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassistedlaser desorption / ionization time of flightmassspectrometry，MALDI-TOF MS)是近年发展起来的一种新型软电离质谱技术，具有快速、准确、操作简便、高通量、低成本等优势，已经被广泛应用于微生物的分型鉴定。由于大肠埃希氏菌（Escherichiacoli，E.coli）和志贺菌（Shigella Castellani）基因水平上同属于一个种，特征性质谱图高度相似，如果仅仅使用目前常用的微生物分型算法进行数据库检索，仍然会有错误鉴定的情况存在。

我公司基于自主知识产权的Ebio Reader^TM 3700M飞行时间质谱系统平台，开发出了一套功能强大的人工智能算法，准确区分基因型相近的难辨菌的解决方案，如大肠埃希氏菌（Escherichiacoli，E.coli）和志贺菌（Shigella Castellani），准确度达到95%以上。

使用Ebio Reader^TM 3700M分别对大肠埃希氏菌（E.coli）、福氏志贺菌(Sh.flexneri)以及两种菌株的混合菌进行质谱鉴定以及蛋白质谱图比较分析。激光频率20Hz，每个样本进行200次激光采集，采集相对分子质量2000Da～15000Da的蛋白质图谱，通过数据分析软件对采集到的3个样品图谱进行比对分析。3种样品均在2691、3737、4869、5381、6255、7274、9067、9743、10300m /z 处出现相似的特征峰，其蛋白质谱图极为相似（图1），如果单纯通过数据库检索的话，极大可能会造成错误鉴定。

图1  大肠埃希氏菌、福氏志贺菌以及混合菌的质谱图

同时，我们分别选取大肠埃希氏菌56例，福氏志贺菌51例，利用Ebio Reader^TM 3700M飞行时间质谱系统进行质谱分析，通过神经网络软件比对观察两组细菌蛋白峰的差异，并运用强大的人工智能算法将采集到的谱图数据建立分类模型，然后利用此模型进行了盲样鉴定。结果可以将大肠埃希氏菌和福氏志贺菌完美地区分开，分离度分别达到99.5%和95.4%，混合菌的分类结果显示大肠埃希氏菌和福氏志贺菌分别为76.2%和23.8%，也说明了此样品为混合样本，且有一定的定量效果，见表1。

表1 大肠埃希氏菌、福氏志贺菌混合菌检测结果比对数据

通过软件的聚类分析功能，更加直观地显示我们建立的这套方案可以将大肠埃希氏菌和福氏志贺菌以及二者的混合菌有效的分离，见图2。

图2  大肠埃希氏菌、福氏志贺菌以及混合菌的聚类分析

在此MALDI-TOF MS微生物自动鉴定检测系统中，采用了自主研发、具有深度学习分析功能的神经网络人工智能软件。通过上述案例证明此套人工智能算法可实现对大肠埃希氏菌和志贺菌的准确区分鉴定，可弥补质谱技术在鉴定亲缘关系相近菌种能力的不足，达到精准医疗的目的，对临床诊断及治疗方面具有重要意义。