新型冠状病毒核酸检测盒探针

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新型冠状病毒核酸检测盒探针

随着新型冠状病毒疫情的扩散，核酸检测试剂盒成了检测病毒的快速有效的途径，目前有核酸检测试剂盒(多重荧光PCR法)、N基因核酸检测试剂盒(荧光PCR法)、ORF1ab基因核酸检测试剂盒(荧光PCR法)三种试剂盒，目前已实现最快8-15分内确诊。其中核酸探针是非常重要的一环。

核酸探针

核酸探针(Nucleic acid prode)是指带有检测标记的已知核苷酸片段，能与互补核苷酸序列退火杂交，并可以被特殊的方法所探知。因此可以用于待测核酸样品中特定基因序列的探测。核酸探针技术是目前分子生物学中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列的有力工具。核酸探针可用以检测任何特定病原微生物，并能鉴别密切相关的毒 (菌)株和寄生虫。目前，各种常见病毒病的诊断和研究都已应用到核酸探针技术

一、基因组DNA探针

这类探针多采用分子克隆从基因文库筛选或用PCR技术扩增制备。由于真核生物基因组中存在高度重复序列，制备探针应尽可能选用基因的编码序列(外显子)，避免选用内含子及其他非编码序列，否则将引起非特异性杂交而出现假阳性结果。

二、cDNA探针

cDNA探针是以RNA为模板，在反转录酶的作用下合成的互补DNA，因此它不含有内含子及其他非编码序列，是一种较理想的核酸探针。cDNA探针包括双链cDNA探针和单链DNA探针。双链cDNA探针的制备方法是首先从细胞内分离出mRNA，然后通过逆转录合成cDNA，再通过DNA聚合酶合成双链cDNA分子。将双链cDNA分子插入载体中克隆、筛选、扩增、纯化，然后进行标记即可。单链DNA探针的制备相对来说要简单些，即将cDNA导人M13衍生载体中，产生大量单链jDNA，标记后即成。用单链DNA探针杂交，可克服双链cDNA探针在杂交反应中的两条链之间复性的缺点，使探针与靶mRNA结合的浓度提高，从而提高杂交反应的敏感性。

三、RNA探针

mRNA作为核酸分子杂交的探针是较为理想的，其优点是：①RNA／RNA和RNA／DNA杂交体的稳定性较DNA／DNA杂交体的稳定性高，因此杂交反应可以在更为严格的条件下进行(杂交温度可提高100C左右)，杂交的特异性更高；②单链RNA分子由于不存在互补双链的竞争陛结合，其与待测核酸序列杂交的效率较高；③RNA中不存在高度重复序列，因此非特异性杂交也较少；④杂交后可用RNase将未杂交的探针分子消化掉，从而使本底降低。但是，大多数mRNA中存在多聚腺苷酸尾，有时会影响其杂交的特异性，此缺点可以通过在杂交液中加入Poly(A)，将待测核酸序列中可能存在的Poly(dT)或Poly(u)封闭而加以克服。另外，RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，因此不易操作也是限制其广泛应用的重要原因之一。事实上，极少使用真正的mRNA作为探针，因为其来源极不方便，一般是通过cDNA克隆，甚至基因克隆经体外转录而得到mRNA样或anti-mRNA样探针。

制备的RNA探针方法是，首先把目的基因cDNA片段插入到含有特异的RNA聚合酶启动子序列的质粒中，再将重组质粒扩增、纯化，用限制酶将质粒模板切割，使之线性化，然后在RNA酶的作用下，从启动子部位开始，以cDNA为模板进行体外转录。在体外转录反应体系中，只要提供有标记的核苷酸原料，经过体外转录后就能获得标记的RNA探针。

四、寡核苷酸探针

采用人工合成的寡聚核苷酸片段作为分子杂交的探针，其优点是可根据需要随心所欲地合成相应的序列，避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带来的不利影响；由于大多数寡核苷酸探针长度只有15～30bp，其中即使有一个碱基不配对也会显著影响其熔解温度(tm)，因此它特别适合于基因点突变分析；此外，由于序列的复杂性降低，因此杂交所需时间也较短。需要注意的是，短寡核苷酸探针所带的标记物较少，特别是非放射性标记时，其灵敏度较低，因此当用于单拷贝基因的Southern印迹杂交时，采用较长的探针为好。

探针的纯化分离

探针的纯化可以使用以下3种方式：

1. HAP纯化方法

HAP是生工生物自主开发的新型oligoDNA纯化方法。该方法已取得国家专利（专利号：200310208040.X）。其原理是利用合成引物5''-端DMT基团对HAP树脂专一性吸附，而不含DMT的短链DNA不被吸附，从而达到分离纯化的目的。

2. ULTRA PAGE纯化方法

PAGE是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化基于尺寸和构象分离全长产物和失败序列，可以分离相差一个碱基的引物(120碱基以内)，从而提供高纯度的引物。纯化后的DNA纯度大于90%。

3. HPLC纯化方法

HPLC 是使用高效液相色谱的原理，依据DNA的疏水性来分离产物的。合成粗产物中不同长度的 DNA 片段的疏水性不同，一般来说较长的片段具有较强的疏水性，AT含量高的片段也具有较强的疏水性。先将粗产物检测主峰位置，再增加加样量，回收主峰位置的部分。该方法用于分离纯化时能达到很高的纯度和灵敏度，可以有效的去除大部分N-短片段，因而可以除去失败序列或未结合的标记物，从而对DNA片段进行纯化。同时配合质谱对DNA进行定性分析，以保证回收片段的正确性。由于HPLC产品的纯度非常高，使用本法纯化的DNA制品可适用于各种基因工程实验。主要用于PCR克隆、定点突变、人工合成基因、长链和修饰引物的纯化等。

WATERS 2695+WFC纯化系统

可以纯化有限数目的样品，特别是精细核苷酸样品

在普通分析型HPLC基础上增加了自动收集组分的馏分收集器WFC III，可以实现自动收集

多种检测器可供触发收集，一般核苷酸纯化采用紫外检测器

依托Waters 2695/2795精确的梯度洗脱能力，可以分离更多的杂质，可以收集到纯度更高的核苷酸产品，甚至单次纯化后的核苷酸纯度达到95%以上

适合短链和较长链核苷酸的纯化，一般应用纯化2OD以上的普通引物样品和修饰引物样品

GE AKTA EXPLORER 纯化系统

快速纯化多种生物分子，如蛋白质、多糖、肽类、寡核苷酸、核苷酸疫苗、病毒及天然小分子（TCM）等，适合分离纯化活性物质。

全自动操作：从进样、编程、分离、峰收集、准确结果比较、数据处理以至打印报告皆自动化

人工智能：多种缓冲液配方（内置17种配方，可自行添加），

三波长紫外/可见光检测：配合pH，电导在线检测，可完全掌握在线分离效果、污染物清除情况和产品鉴别

THERMO LTQ HTCS核酸质谱检测系统

HTCS核酸质谱检测系统专为生物工程领域中DNA、RNA等高分子化合物的分子量快速鉴定而开发系统依托于Thermo LCQ/LTQ系列离子阱质谱仪的优异定性鉴定功能，CTC PAL高速进样器的快速取样特性以及专属的Promass质谱解析软件可以一键处理得到待测化合物的原分子量信息

高通量：采用双柱切换系统，每天可以进样并处理超过2000个样品，平均每1min采集一个样品。

基于大量用户检测数据分析，基于LTQ体系的HTCS系统在核苷酸分子量5万以内的检测效果较为优越

基泰

专注于

二手分析仪器

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