【领读】治疗脂质代谢紊乱新靶点，或成肥胖症新福音？

2020-08-12 17:42:26, 小肚子美谷分子仪器（上海）有限公司

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● 受基质互作分子 STIM1 和 STIM2、钙离子通道 ORAI1 调控的 SOCE 可调节脂质代谢；

● 线粒体功能和脂肪酸氧化 (FAO) 都需要 SOCE；

● SOCE 制 cAMP 依赖性的 PGC-1α/PPARα 表达和脂解作用；

● SOCE 的缺失均能导致小鼠体内及人类患者细胞内的脂滴发生病理性堆积；

● 综上可推断 SOCE 依赖的信号通路是治疗脂质代谢紊乱的潜在新靶点；

SOCE——Store-operated Ca2+ entry（钙池操控性Ca2+内流通路）是一种广泛存在于哺乳动物体内的非常重要的 Ca2+ 内流通路，它受基质相互作用分子 1 （STIM1）、STIM2 和 Ca2+ 通道 ORAI1 调控。

本文发现缺失 SOCE 的小鼠肝脏、心脏和骨骼肌中，积累了病理数量的脂滴。来自 STIM1 或 ORAI1 功能缺失突变的人类患者的细胞也显示类似的表型，这提示了 SOCE 在调节脂质代谢中发挥细胞内在作用。

SOCE 是诱导脂解作用和线粒体脂肪酸氧化的关键，并且调节 cAMP 的产生和中性脂肪酶的表达，以及脂质代谢的转录调节因子、过氧化物酶体脂化酶激活受体-辅激活因子 1α （PGC-1α）和过氧化物酶体增殖激活受体 α （PPARα)）的表达。敲除 SOCE 功能后细胞会上调脂溶性，以保护其免受脂毒性。

以上数据均为 SOCE 在脂质代谢中的重要作用提供了证据。

本文的实验要点

钙流检测：

贯穿全文的检测手段，本文主要有两种方案：

a. 酶标仪测定法，通过 Fura-2 荧光标记细胞，用多功能酶标仪 Flex station 3测钙流变化曲线；

b. 单细胞成像法，利用荧光显微镜对 Fura-2 标记细胞进行单细胞钙流成像。

二者特点：酶标仪测定法通量大，操作简便，数据更具统计学意义；单细胞成像法操作稍复杂，数据量有限，且耗时长，但结果直观可靠，可呈现动态图像佐证数据结果，一般作为辅助手段进行。

线粒体功能检测：

电子传递速率 ETC：

a. 检测 O2- 浓度；

b. 线粒体膜电位（MMP）。

线粒体呼吸功能：

检测线粒体耗氧量（OCR）。

线粒体脂肪酸氧化（FAO）率：

a. 底物氧化压力测试；

b. 14CO2 追踪法。

蓝绿温和胶凝胶电泳（BN-PAGE）：

多用于哺乳动物和真菌线粒体中的多亚基蛋白复合物，后来也被用于各种生物膜类如类囊体膜和叶绿体膜的研究。

透射电镜：

以图像表征脂滴含量。

结果

受损的 SOCE 导致脂滴（LD）在细胞和组织中积累

文中使用表达非功能性 ORAI1 通道蛋白的 Orai1R93W 敲除小鼠，该蛋白可以失活 SOCE 功能。

透射电镜 (TEM) 和油红染色均显示 Orai1R93W 敲除小鼠心脏和骨骼肌中脂滴（LDs）的含量异常（图 1A 和图 1B）。成年小鼠的组织中敲除 Stim1 和 Stim2 基因，也可失活 SOCE ，从心肌、骨骼肌和肝脏的组织学检测显示，与注射了他莫昔芬的 Cre 阴性同伴相比，失活 SOCE 的成年小鼠发生了 LDs 病理性的积累（图 1C）。ORAI1 p.G98R 患者肌肉活检的TEM也显示了 LD 沉积（图 1D）。

总的来说，这些发现表明 SOCE 在体内和体外控制小鼠和人类的脂质稳态方面具有保守的作用。

图 1. 透射电镜（TEM）和油红 O 染色显示 LDs 含量变化

线粒体基因表达、功能和脂肪酸氧化都需要 SOCE

细胞内的脂质分解代谢依赖于线粒体，线粒体功能的降低会导致甘油三酯在肌肉和肝脏中积累。

由于细胞内 Ca2+ 调控线粒体功能，研究者测试了 SOCE 在线粒体功能中的特定作用与线粒体缺陷细胞中较高的脂质含量之间的关系。利用线粒体标记物发现 ORAI1 或 STIM1 功能缺失患者的成纤维细胞中，线粒体体积下降（图 2A 和 2B 、S1）。并且线粒体中对氧化磷酸化至关重要的电子传递链（ETC）复合物 CI、CIII 和 CIV 的组分表达在 SOCE 缺失的成纤维细胞中减少，而复合物 CII 和 CV 表达正常（图 2E 和 S2A）。

这一结果用 blue native PAGE （BN-PAGE）对分离的线粒体进行分析时，也完全吻合（图S2B）。线粒体膜内质子转运体解偶联蛋白 2 （uncoupler protein 2, UCP2）的 mRNA （图 2E）和蛋白（图 2F）表达也出现严重缺陷。UCP2 受脂肪酸等因素控制，可降低线粒体膜电位（MMP）和活性氧（ROS），以防止线粒体损伤。

通过TEM观察到 Orai1R93W 敲击小鼠骨骼肌和心脏中损伤线粒体的数量也较高（图 S1）。与UCP2表达降低相一致的是，与对照组细胞相比，SOCE缺乏患者细胞的基础 MMP 水平显著升高（图 2H 和 2I）。

本文通过测量在含油酸（OA）培养基中培养成纤维细胞的细胞 O2 利用率来评估线粒体脂肪酸氧化（FAO）。在 OA 培养中，健康供体和 SOCE 缺乏患者的成纤维细胞显示了相当低水平的 O2 消耗（图2S）。

在对照组中，饥饿导致 CPT1 抑制剂 etomoxir 敏感的线粒体呼吸急剧增加，而在 SOCE 缺乏的患者细胞中则没有（图2S）。为了直接量化 FAO，测量了在含 14C -OA 培养基中细胞的 14CO2 释放量。与健康供体成纤维细胞相比，在 OA 中培养或在 OA 中培养后再饥饿时，SOCE 缺陷患者成纤维细胞的 FAO 率降低（图 2T）。

综上数据显示，SOCE 控制了几种关键线粒体酶的表达，包括解偶联蛋白等成分，以及与 FAO 有关的酶，从而调节线粒体功能和 FAO。

图 2.线粒体相关功能的检测

SOCE 通过控制脂肪酶表达和腺苷环化酶依赖性信号通路调节脂解

接下来，在葡萄糖培养基、OA 培养基或OA 培养基中培养后再饥饿 24 小时的成纤维细胞进行 BODIPY 染色，结果显示，在饥饿反应中，HD 成纤维细胞可以很容易地分解大约一半的储存 LDs，而 SOCE 缺乏细胞则出现验证的 LD 分解缺陷（图3A）。

通过游离脂肪酸（FFA）（图 3B）和甘油（图3C）测定，在高糖或 OA 培养后饥饿时，与对照组相比，SOCE 缺乏细胞的脂肪分解显著降低。同样，小鼠 NIH 3T3-L1 细胞表达敲除 SOCE 的ORAI1 （DN-ORAI1）（图3D），在高糖培养基或 OA 培养基中培养后，饥饿时的脂肪分解明显减少（图3E）。异丙肾上腺素均无法修复以上两种缺陷（图3C 、3E）。

为了了解在没有 SOCE 的情况下脂肪分解受损的机制，文中分析了中性脂肪酶激素敏感脂肪酶（HSL)、脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）和单酰基甘油脂肪酶（MGL）的表达量。在 SOCE 缺失的成纤维细胞中，HSL 和 ATGL 的表达在 mRNA 水平（图3G）和蛋白水平（图3H）均降低，而 MGL 没有变化。在缺氧的 NIH 3T3-L1 细胞中，高糖或 OA 培养基中培养并饥饿后，cAMP 水平显著降低（图3J）。Thapsigargin 刺激后，对照组细胞中cAMP 水平显著升高，（图3J）。

Forskolin 加 IBMX 处理的 SOCE 缺失成纤维细胞则将 cAMP 恢复到野生型水平（图3J）。在 SOCE 缺失患者的成纤维细胞中也观察到类似的 cAMP 生成缺陷（图3K）。

以上都揭示了 SOCE 调节中性脂肪酶 HSL 和 ATGL 的表达以及 cAMP 依赖性的 HSL 激活，从而控制脂解。

图 3.脂肪酶表达及 cAMP 分析

SOCE 缺失细胞出现脂质保护机制的上调

除了传统的脂解作用，LDs 还可以通过脂解作用被靶向进行溶酶体水解。在患者细胞中免疫印迹的自噬小体标记物微管轻链蛋白 3 （LC3）不受溶酶体蛋白酶抑制剂的影响，这显示 LC3-II 持续较高的稳态水平和自噬通量的增加，表明在缺乏 SOCE 时拥有较高的自噬水平（图 4 a 和 4 b）。

使用串联荧光 LC3 结构可用于测量自噬体的含量（如 mCherry +和 GFP +荧光斑点）和自噬体成熟为自噬溶酶体（如 mCherry + only 点状体）。与免疫印迹数据一致的是，SOCE 缺失细胞中自噬体和自噬溶酶体的含量明显高于对照组（图 4C和 4D）。

对 Orai1R93W 敲除小鼠骨骼肌中 LDs 的分析也显示，这些动物中 LDs 的比例显著更高（图S3I-S3K）。同时使用特异性短发卡 RNA 消除自噬相关蛋白 7 （ATG7）的表达，该蛋白对自噬小体的形成至关重要。ATG7 的缺失（图 4J）导致培养于 OA 或 PA （棕榈酸）的 SOCE 缺失细胞的活力显著下降，而对受脂质压力的 WT 细胞活力或患者细胞对高糖水平的敏感性则没有影响（图 4K）。

综上所述，这些结果表明，SOCE 缺乏细胞中脂噬的增加可以弥补传统脂质分解的损失，并作为一种对抗脂质毒性的保护机制。

图 4. SOCE 缺失细胞的脂溶性增加

PGC-1α 和 PPARα 对脂质代谢的转录调控依赖于 SOCE

哺乳动物通过激活脂肪组织中的脂解作用来适应长时间的禁食，从而释放脂肪酸进入循环。

为了适应大量的脂肪酸，肝脏和其他器官通过转录参与脂肪酸利用的基因来重新编程新陈代谢。PPARα及其协同调节因子PGC-1α 被确定为肝脏和心脏禁食反应的转录调节因子，结果发现表达水平降低的 Cox4l1、UCP2（图2E）、CPT1b、ACADVL（图 2Q 和 2R）、HSL 和 ATGL（图3G 和 3H），全都是 PGC-1α 和 PPARα 的靶基因，揭示了 SOCE 在禁食反应的转录调控中发挥作用。

与对照组相比，我们观察到在 SOCE 缺失的患者细胞中 PGC-1α 和 PPARα 的基础水平显著降低，并且在 OA 和饥饿后培养后，它们的表达诱导受损（图 5A）。在分析 SOCE 缺失的 NIH 3T3-L1 细胞时也得到了类似的结果(图5B)，表明 SOCE 在调节小鼠和人类的 PGC-1α 和 PPARα 表达方面具有保守作用。

尽管在某些情况下，PPARα 会刺激脂质水解，但在SOCE 缺失细胞中，自噬的上调是通过与 PPARα 无关的机制发生的。因此，尽管PPARα信号通路减弱，但 SOCE 缺失细胞 TFEB 的 mRNA 和蛋白水平显著升高（图S3和S5C）， TFEB 是介导PPARα 诱导自噬的转录因子。在 SOCE 缺失细胞中，TFEB 的转录上调对受体激动剂或拮抗剂对PPARα 信号的调节不敏感（图S5C）。

总的来说，这些发现表明，在 SOCE 缺失细胞中，自噬的上调是对 PPARα 信号丢失的一种响应。

为了更好地理解 SOCE 调控 PGC-1α 和 PPARα 表达的机制，还分析了 cAMP 反应元件结合蛋白（CREB）的磷酸化，CREB 是一种调控 PGC-1α和 PPARγ 表达的转录因子。

结果发现 SOCE 缺失细胞中 CREB 磷酸化受损，通过提高 cAMP 水平，Forskolin 和 IBMX 处理可以挽救这些细胞，提示 SOCE 调节 ACs 上游的CREB磷酸化(图5E)。另外在禁食 WT 动物的心脏和肝脏中，PGC-1α 和 PPARα （图 5H 和 5I）和STIM1 的表达增加，但 ORAI1 的表达没有增加（图 5H 和 5I），这可能是为了适应更多的脂肪酸。

综上所述，这些数据表明，SOCE 通过控制 PGC-1α 和 PPARα 的表达，指导了细胞对脂肪酸利用的转录重编程。