知己知彼，科学抗疫（5）- 质谱流式在虫媒病毒和疱疹病毒中应用举例

2020-05-03 20:15:47, Fluidigm 思百拓（上海）仪器科技有限公司

病毒感染人体后，激活免疫系统，产生免疫反应。免疫系统所涉及的免疫亚群众多，每种免疫亚群有其特定的标志物。目前的传统流式由于通道的限制，很难满足对免疫反应的系统全面研究，也很难实现大规模T细胞结合表位的筛选。而这些深入理解对病毒治疗方案，疫苗研发，疫苗效果评估等有着不可取代的意义。质谱流式技术采用金属标签代替传统的荧光标签，质谱检测代替荧光检测，从根本上解决多通道串色问题，因而可实现在单细胞水平检测几十个通道的同时检测，可以系统全面的分析病理状态下各类免疫细胞在表型和功能上的变化，从中发现一些新的免疫细胞亚群、揭示新的免疫机制。由于其特有的优势，质谱流式广泛应用于各类病毒研究中，涉及到各类应用方向。本文对质谱流式在虫媒病毒及疱疹病毒中的应用进行总结。

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虫媒病毒

虫媒病毒是以节肢动物为媒介的病毒，通过昆虫(如蚊、蟑螂、苍蝇、跳蚤、虱子)和蜱叮咬而在脊柱动物间传播。其宿主范围较广，可引起发热，脑炎和出血热等。虫媒病毒在全球分布范围广泛，城市型黄热病，白蛉热，基孔肯雅病及登革热等虫媒病毒病人及隐性感染者可成为主要传染源。登革热病毒依抗原性不同分为1、2、3、4四个血清型，其中2型传播最广泛。其感染会导致发病率和死亡率很高的登革出血热和登革休克综合征。这些疾病广泛流行于热带和亚热带地区，是一种分布广、发病多、危害较大的人类传染病。在亚洲，太平洋群岛及中、南美洲等许多国家均已造成严重的威胁。

质谱流式在虫媒病毒方面的研究主要集中在登革热病毒（DENV）^[^1-3^]，基孔肯雅病毒（CHIKV）^[⁴^,⁵^]和西罗尼河病毒^[⁶^]三个领域。

1978年，广东佛山首次发现DENV感染患者，之后在海南岛及广西等地均有发现。该病毒感染机体后，首先在毛细血管内皮细胞增殖，并释放入血形成病毒血症，然后进一步感染血液和组织中的单核-巨噬细胞而引起登革热。预防接种尚无安全、有效的登革病毒疫苗。在DENV病毒研究中，为了给研发有效疫苗提供理论基础，质谱流式在DENV感染者中进行T细胞结合表位筛选^[¹^]，特异性T细胞亚群特征及分化命运研究，不同亚型病毒感染背后免疫机制等方面都有所应用。T细胞在DENV感染中起到多种重要作用，深入理解其免疫反应对于研发有效疫苗有重要的意义。质谱流式对急性登革热病毒感染者免疫微环境多通道细胞因子综合分析发现其特异性T细胞特征为IL10+IFNγ+CD4+^[²^]。Chng, M. H. Y等人结合质谱流式和多肽-HLA四聚体技术在感染者体内追踪DENV特异性T细胞激活及分化情况，发现在急性感染者体内，T细胞出现大量活化和增殖，活化的T细胞主要分化为两大亚群：CD57+ CD127– 和CD127+ CD57–亚群。得益于质谱流式多痛单细胞检测的优势，多肽-HLA四聚体技术用金属标签代替传统荧光标签，从根本上解决通道间串色的问题。与用一种金属标记一种抗体的标记方式不同，多肽-HLA四聚体技术用三种金属标签组合标记一种多肽，将位点筛选通量进行了大大的提升。在本文中实现了对430种T细胞结合位点筛选，在登革热病毒M区域发现两个此前未知的表位^[¹^]。这些免疫机制对疫苗的研发具有很好的指导意义。

针对DENV治疗方案的改善，质谱流式的研究也提供了详实的理论依据。DC细胞作为首次感染的最初靶标，其反应会影响感染结果。与DEVC-2相比，DEVC-4复制的峰值更早出现，引发更强烈的固有免疫反应，DC的激活和迁移标志物表达均有升高，分泌的IFN-induced细胞因子也更多^[³^]。这说明虽然都是登革热病毒，两种不同的病毒类型的病原机制并不相同，为后续的治疗方案提供理论依据。

针对CHIKV的研究主要集中在CHIKV感染导致关节炎和感染儿童固有免疫微环境两方面。有些CHIKV感染患者会引发持续数月或数年的炎症关节炎，这种疾病很容易被误诊为风湿性关节炎，导致治疗错误。Miner, J. J.等人利用质谱流式对CHIKV感染诱发关节炎患者，风湿性关节炎患者及健康人的PBMC进行分析，发现两种关节炎患者体内均存在大量活化的CD4、CD8效应T细胞。这项研究表明在诊断多发性关节炎时需要考虑CHIKV因素^[⁴^]。此外，Michlmayr, D.等人利用质谱流式和RNAseq对基孔肯雅病毒（CHIKV）儿童感染者固有免疫进行分型。发现急性感染期是由单核细胞驱动免疫反应，CD14++CD16+的单核细胞和CD14+的单核细胞数量均有很大提升^[⁵^]。该研究提供了CHIKV感染后全面生物分子标志物的免疫微环境，对于今后的治疗提供强大理论基础。

西罗尼河病毒的数据用于验证一种半自动圈门算法DeepCyTOF的准确性，利用这种算法，可大量节省人力物力，实现半自动精准圈门^[⁶^]。

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疱疹病毒

疱疹病毒（herpes virus）是一群有包膜的DNA病毒，生物学特性相似。目前总共发现了100多种，可以分为α、β、γ三大类（亚科）。α疱疹病毒（如单纯疱疹病毒、水痘一带状疱疹病毒）增殖速度快，易引起细胞病变。β疱疹病毒（如巨细胞病毒），生长周期长，感染细胞形成巨细胞。γ疱疹病毒（如EB病毒），感染的靶细胞是淋巴样细胞，可引起淋巴增生。其感染宿主广泛，主要侵害皮肤、黏膜以及神经组织，感染部位和引起的疾病多种多样，并有潜伏感染的趋向，严重威胁人类健康。此处分别对质谱流式在三类疱疹病毒中的应用进行总结。

质谱流式关于疱疹病毒的研究主要集中在以下三个方面：1α疱疹病毒：水痘带状疱疹病毒（VZV）感染皮肤信号通路分子机制^[^7-9^]，2 β疱疹病毒：巨细胞病毒（HCMV）和γ疱疹病毒巴尔病毒（EBV）感染在移植后患者体内引发的免疫亚群变化，3 γ疱疹病毒巴尔病毒（EBV）感染XMEN疾病分型。

VZV感染人体扁桃体后，会往皮肤转移。在感染后，VZV会改变T细胞表面结构及标志物表达情况，使其更倾向于像皮肤转运^[⁹^]。这背后存在TCR依赖和非TCR依赖两种分子机制。TCR依赖机制中，T细胞表面结构重塑是通过病毒感染后激活TCR和PIK3激酶通路而触发^[⁸^]。Naïve T和记忆性T细胞中存在非TCR依赖机制，Zap70和Akt信号通路被激活，之后触发T细胞表面标志物的改变^[⁷^]。除了信号通路研究外，质谱流式还应用于第一例VZV引发噬红细胞性淋巴组织增生症患者（HLH）的病理报告中。对患者血样分析发现存在双阴性T细胞亚群增多^[¹⁰^]。

移植后患者体内的免疫反应需要被抑制，在此情况下，患者更易受到病毒感染。质谱流式在接受器官移植后患者体内巴尔病毒（EBV）和巨细胞病毒（CMV）^[¹¹^]感染导致的免疫反应做出了系统性研究。经过对比造血干细胞移植患者CMV阳性及阴性患者免疫微环境变化，发现CMV阳性患者体内的HLA-C表达水平在多种免疫细胞中均有升高。且在CMV阳性患者体内发现一类特异性存在的killer cell Ig-like receptor (KIR)阳性CD8 T 细胞^[¹¹^]。CMV感染会导致病毒血症，对患者健康有严重影响，甚至导致死亡。但是对于病毒血症患者体内的免疫反应目前缺乏深入了解。Ferreira, V. H.等人利用质谱流式对病毒血症患者CD8+ T细胞进行详细的免疫分型，发现预后差的病毒血症患者体内缺乏活化和终末分化的CD8+T细胞。CD8+T细胞的细胞因子分泌情况在预后好的患者体内多样性更好^[¹²^]。Ferreira, V. H.的另一成果为利用质谱流式在实体器官移植者的研究，发表文献阐述了自限性EBV DNAemia的相关固有免疫及T细胞亚群组成特点^[¹³^]。这些结果对于以后的治疗方案提供了很好的方向和潜在靶点。

除了实体瘤移植领域，EBV病毒感染还常伴随XMEN疾病出现。X染色体性联免疫缺乏合并镁缺乏(M)、EB病毒(E)、肿瘤(N)疾病（XMEN疾病）是由X染色体MAGT1基因突变引起的遗传性疾病，EBV感染常见引发B细胞恶性增殖。在一些病人体内会诱发自身免疫淋巴增生综合征（ALPS）。利用质谱流式对XMEN患者，ALPS患者免疫细胞的综合分析，最终确定了XMEN、ALPS疾病判定标准^[¹⁴^]。具有很重要的临床应用意义。

~ 小结~

本文对质谱流式在虫媒病毒和疱疹病毒中的应用进行总结。在所列出的文献中涉及到的质谱流式应用方向有：1病毒感染T细胞识别表位筛选，2免疫微环境整体变化研究，发现病毒感染特异性免疫细胞亚群特征，3确定疾病分型，发现biomarker的研究，4病毒感染的信号通路分子机制研究，5 病例报告。质谱流式由于其可对单细胞进行高通道检测，可提升单次表位筛选通量，检测免疫亚群覆盖度，轻松实现磷酸化蛋白，胞内蛋白及核内蛋白等特点，在以上所列举的应用方向均有着不可替代的作用和优势，近年来广泛受到科研界认可。

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