【基因组学】一网打尽各类遗传变异，我们不靠算法美颜数据

2018-11-10 11:01:17, 安捷伦 DGG 团队安捷伦科技（中国）有限公司

遗传性疾病（包括单基因病、发育障碍、智力障碍）以及癌症的基因变异种类各式各样，从常见的，小到一个或数个碱基对的变化，到大的染色体水平的变化。二代测序技术的发展使得对单核苷酸变异（SNV）和小的插入/缺失（InDel）的识别变得越来越方便，然而在孟德尔疾病数据库（HGMD）报导的 141,000 个基因组损伤中，有 10% 是与拷贝数变异（CNV）相关的，它们中的一部分还与常染色体隐性遗传病相关 [1]。因此，对 CNV 的检测就同等重要。在对疾病基因组背景的分析时，对于这些由小到大的各类变异的检测，一个都不能少。

高深度全基因组测序与全外显子组测序在 CNV 的应用上有各自的局限性

高深度的全基因组测序可以同时实现 SNP 检出以及高分辨率拷贝数分析，但是这种大量的测序要求不符合多数临床实验室对高通量和低成本的要求，同时解析海量数据的难度也影响了它的常规应用。

一些实验室将对 CNV 的分析整合到全外显子组测序（WES）的生物信息学分析中，目前也有多个生物信息分析工具可以实现基于全外显子测序数据的 CNV 分析，但是检测结果并不十分可靠，且缺少标准的流程。全外显子测序检测 CNV 的局限性主要是由于全外显子探针设计的叠瓦式加密策略，在提高捕获特异性、覆盖度和均一性的同时，可能导致原始丰度信息的失真。

另一方面，很多 CNV 的断裂点并不在外显子区域，无法像全基因组测序那样准确的检测到。还有大量高频次等位基因 SNP 也不在外显子区域，使得传统的 WES 数据检测 LOH 的能力下降。除了探针的设计与覆盖外，测序的技术、读长，以及上下游序列同样会影响 CNV 检测的准确性。

而在临床实践中，由于 WES 并不覆盖非编码区的 CNV，而非编码区的 CNV 对其两侧的基因表达具有潜在的调节作用，因此，一些实验室会对 WES 阴性或特定基因 Panel 检测为阴性的结果再行染色体芯片分析，来避免假阴性的结果。这就导致了得出最终报告需要使用多种检测手段，因不同病例而异，且都是基于最接近的遗传变异假设来决定的 [1]，没有统一的执行标准。

如果有一个检测可以在同一时间检测出最多种类的遗传变异，它就可以极大程序减少检测的数量、费用，以及得出报告的时间。

有一种检测，它基于二代测序的基因 Panel，在报告 SNV 和 Indel 的同时还能提供 CNV 和 LOH 的信息。它不需要特殊的设备，只需要一台常规的二代测序仪——来自安捷伦二代测序捕获 Panel 大家族的 OneSeq。

图 1. OneSeq 可同时检测 CNV、SNP/Indel 和 LOH

OneSeq 靶向序列捕获技术之所以能够同时检测 SNV、CNV、LOH 是因为它在用于检测 SNV 和 Indel 的普通外显子靶向捕获的基础上增加了额外的两类探针。第一类基于基因组骨架区域进行设计，专门用于检测 CNV。这些探针并不像外显子区域的探针，它使用不同的 Tilling 策略，大部分位于内含子上的保守区域。设计的同时，考虑到不同探针在基因组上的分布距离，这组探针的设计非常类似我们 CGH（比较基因组杂交）芯片的探针。通过比较待测样本和参照样本上同样区域的 Reads 数比值来精确的检测 CNV。第二类探针是针对基因组区域中高频次等位基因 SNP 区域设计，用于检测 LOH。加入了这两种探针的探针组合就可以同时检测 SNV 、Indel、CNV 和 LOH 了。

图 2. OneSeq 探针设计示意图

安捷伦于 2015 年推出 300k CNV 分辨率的 OneSeq 版本，又于 2016 年进一步推出 1M CNV 分辨率的版本。现在 OneSeq 还支持灵活的定制，用户可以选择将自己需要的目标基因组合与 CNV 骨架组合在一起，在检测自己感兴趣的目标基因的同时检测 CNV。

已经有国外的用户成功地将这一应用付诸临床，极大的帮助临床人员缩短报告时间、节约检测成本。在一篇由意大利的研究团队发表的论文中，研究者选取了 17 例经传统细胞遗传学方法（核型分析）及分子细胞遗传学方法（比较基因组杂交芯片、 Sanger 测序、MLPA 分析）检测过的病例，用 OneSeq 方法对它们分别进行了检测并与先前的检测结果进行对比。

结果显示，OneSeq 可以检测的变异类型广泛，很大程度上克服了 WES 由于读数分布不均一以及由于覆盖区域仅局限于外显子区域而带来的在 CNV 检测上的局限性。研究人员从比较基因组杂交芯片和 OneSeq 这两种不同方法获得的结果具有高度的一致性，由芯片和 OneSeq 得出的 CNV 的大小也有高度的一致性 [1]。研究人员在实验中所使用的 Panel 具有 300 kb 的基因组骨架分辨率，可以用于检测 400 kb 或大于 400 kb 的 CNV，这一分辨率与“ACMG 染色体微阵列芯片细胞遗传学分析标准和指南”里推荐的一致 [2]。

OneSeq 可以检测常规 WES 和低分辨率芯片平台可能错过的变异。在这 17 例病例中，每一例都带有不同类型的遗传变异。在 1 到 4 号、6 和 7 号病例中，OneSeq 正确地检测到所有的先前由 aCGH 确定的 CNV。其中包括常规细胞遗传学和 SMC（额外标记染色体）可见的大型重排，以及从 260kb（案例 4）到 1.4 MB 的微缺失/重复（病例 2）。其中，病例 3 的 SOX9 基因上游非编码的 RevSex 区域存在一个重复，它与 46，XX 个体的睾丸发育相关，在常规 WES 方法以及低分辨率的芯片平台下很可能会错过该变异。

对于一些复杂病例，OneSeq 仅通过一个单一实验就完成最终的分子诊断。在 11-15 号这 5 个受常染色体隐性遗传影响的病人/胎儿的病例中，基因组的变异包含了复合的杂合性，他们在一个等位基因上有一个点突变，而在别一个等位基因对应的区域有范围从 21 kb 到 400 kb 不等的缺失。另一个病人（病例 17），在 4 号染色体上发生了母系单亲二倍体导致杂合性缺失，而在该区域的 WFS1 基因上又发生了杂合性变异 c.1348_1350delinsTAG。对于这些复杂病例，OneSeq 仅通过一个单一实验就完成最终的分子诊断，而先前研究人员是通过了多种检测手段才最终得以做出分子水平的诊断，所采用过的手段包括 Sanger 测序，MLPA 和全基因组阵列分析。看来在这些复杂病例的诊断上，OneSeq 完美胜出。

图 3. OneSeq 从样本到数据的 CNV、LOH 和 SNP 的一体化工作流程

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*该产品仅用于科研，不可用于临床用途。

参考文献：

[1] Diagnostic application of a capturebased NGS test for the concurrent detection of variants in sequence and copynumber as well as LOH. Clin Genet.2017 May 30. doi: 10.1111/cge.13060. [Epub ahead of print]

[2] ACMG Standards and Guidelines forconstitutional cytogenomic microarray analysis, including postnatal andprenatal applications: revision 2013. Genetics in medicine : official journalof the American College of Medical Genetics 2013: 15: 901-909.