【干货】细胞骨架荧光标记技术（上篇）

细胞骨架包括微丝、微管和中间丝3种结构组分，它们都是由相应的蛋白亚基组装而成。细胞骨架是一种高度动态的细胞结构体系。在细胞周期的不同时期，细胞骨架具有完全不同的分布状态；在体内各种不同分化状态的细胞中，不仅细胞骨架分布状态存在很大的差异，甚至连构成细胞骨架的蛋白组份也不尽相同。

细胞骨架在细胞内发挥着重要的机械支撑与空间定位作用，同时还是真核细胞结构与功能的重要组织者。细胞骨架不仅与细胞的形态发生相关，而且还参与几乎所有形式的细胞运动，如肌肉的收缩、变形运动、细胞迁移、染色体向极运动、纤毛及鞭毛的运动、细胞器和生物大分子的运输、细胞质内生物大分子的不对称分布等。此外，与细胞内的信号传导、免疫行为和细胞分裂等活动也有密切的关系。

可是细胞骨架的发现却较晚，主要是因为一般电子显微镜制样需要低温固定，而细胞骨架会在低温下解聚。直到1963年，Slauterback采用戊二醛常温固定，才真正看到细胞骨架的存在。细胞骨架作为细胞的最基本和最容易进行荧光标记的结构之一，备受科研工作者的青睐，在显微成像中经常可以看到细胞骨架标记的出现。而微管蛋白(tubulin)和肌动蛋白(actin)作为细胞骨架的重要组成部分，是最常被研究的细胞骨架蛋白。目前用来标记微管蛋白和肌动蛋白以探究细胞骨架动态结构的方法很多，本文简要总结一下常用的标记方法。

肌动蛋白是多数真核细胞中含量最丰富也是最重要的一种蛋白。肌动蛋白在细胞内有两种存在方式：肌动蛋白单体（G-actin）和由肌动蛋白单体组装成的肌动蛋白丝（F-actin）。肌动蛋白丝即微丝，为直径7nm的纤维状结构，与几乎所有形式的细胞运动有关，如维持细胞的形态、肌肉收缩、细胞变形运动、胞质分裂以及细胞内物质运输等。荧光标记的肌动蛋白是用来对细胞骨架的动态结构进行观察的一种有效手段。

常见的微丝标记方式有：

显微注射带有荧光标记的G-actin：常见的有rhodamineB，TexasRed及Cy5 和 Alexa Fluor系列染料与肌动蛋白单体交联标记。只是这种方法在进行活细胞标记时不是很方便，如果需要对活细胞细胞骨架的动态过程进行观察，actin-GFP这类融合荧光蛋白探针更合适。

图1[2] (a)由C3F8气体堆芯和磷脂单分子层组成的阳离子微囊泡示意图。 (b)加入预聚合的F-actin, (c)加入凝胶素蛋白，(d)处于非聚合状态的G-actin在液相脂质中(e) 处于非聚合状态的G-actin在凝胶态脂质中，分别形成的微囊泡外壳。(b, c, e) 中脂质组成为(4 : 1 DPPC–EDPPC)，(d)中脂质组成为(4 : 1 DOPC–DOTAP)。Actin用rhodamine 标记。

但是在一些离体实验中直接用染料标记G-actin的应用还是很多，比如用于载药和诊断体系的微囊泡结构的研究。微囊泡的特性与其结构密切相关，StephenD. Evans[2]等利用微丝自组装过程构建出了肌动蛋白包被的阳离子脂质微囊泡：将rhodamine标记的G-actin加入带正电荷的微囊泡组分中进行聚合。借助荧光成像对微囊泡结构进行分析，发现加入不同的成分会得到不同的结构特征的微囊泡：加入鬼笔环肽形成的微丝长度从9μm增到18μm，随着G-actin浓度的增加，微丝在微囊泡上的分布也会由单根变成聚集体（图1(b)）；加入凝胶素蛋白则会形成较均一的300nm微丝（图1(c)）。如果改变微囊泡的组分(DOPC–DOTAP4 : 1)则会得到具有均匀分布的微丝外壳的微囊泡（图1(d)）。且actin的引入使微囊泡的硬度和弹性增加，对气体渗透的抵抗能力也增加三倍，半衰期从68min延长到126min，更适合用作载药体。

显微注射鬼笔环肽[3]荧光探针：鬼笔环肽及其衍生物可在纳摩尔水平特异性结合F-actin，且对不同大小的微丝亲和力相同，结合比例均为1:1。鬼笔环肽只与F-actin结合，不与G-actin结合，结合特性也不因物种不同而改变，且其非特异性结合几乎可以忽略，因此得到的图像信噪比很高。此外，鬼笔环肽非常小，直径为12-14Å，分子量小于2000Da，结合后所占空间小，因此与偶联有荧光素的鬼笔环肽结合不会影响肌动蛋白与肌动蛋白结合蛋白的相互作用，比如肌球蛋白等。更为重要的是结合有鬼笔环肽的微丝的功能并不会受到影响。

而常用的偶联鬼笔环肽的荧光素有罗丹明、TexasRed、FITC和Alexa Fluor系列染料等。这类荧光探针很多。传统的NBD标记的鬼笔环肽很容易发生淬灭，这使得成像的难度大大增大。而BODIPY标记的鬼笔环肽就比这些传统的NBD、荧光素、罗丹明标记的鬼笔环肽的光稳定性更好，且发射光谱区带窄，更适用于多重标记实验。罗丹明标记的鬼笔环肽光稳定性也较好，且可竞争性地与肌动蛋白结合，结合后荧光强度增加9倍，适用于F-actin的快速定量。

标记F-actin结合蛋白：脱氧核糖核酸酶I（DNaseI）与G-actin的结合能力远强于与F-actin的结合能力[4]，当DNaseI标记上荧光素、罗丹明或Texas Red等荧光基团时，可以用来对肌动蛋白单体进行定位和定量分析。如果与标记有荧光的鬼笔环肽结合使用可同时观察到F-actin和G-actin，从而研究非肌肉细胞中微丝的动态结构组织过程。AnthonySadler等[5]在探究细胞骨架与天然免疫的机理时就用Alexa488 phalloidin标记F-actin，TRITC- DNase I标记G-actin，从而得到微丝结构的动态变化。并发现抗病毒蛋白激酶R（PKR）可通过抑制凝溶胶蛋白（微丝修饰蛋白）来调节微丝的组装并进一步调控自平衡状态下细胞骨架的一些功能，在天然免疫过程中发挥重要作用。

图2[5] F-actin与G-actin在野生型和PKR-deficient 型细胞中的比例变化。

上述每种方式都能提供微丝在活细胞中的分布的基本信息，但都有一些不足之处。带有荧光的G-actin一般是通过连上化学荧光团得到的，这就有可能改变肌动蛋白的组装以及与组装相关的细胞活动，而且也不可能标记上所有的F-actin，因为在任何特定时间都只会有一部分肌动蛋白是处于聚合状态，这就会造成较高的背景荧光。鬼笔环肽与肌动蛋白微丝结合使微丝结构更加稳定，破坏了肌动蛋白的动态平衡。而第三种可以减少肌动蛋白动态组装带来的干扰，但是也有报道指出微丝结合蛋白在一些情况下也会影响到依赖于肌动蛋白组装的一些生命活动。

微管呈中空的管状结构，外径为24nm，内径12nm，大部分微管在细胞质内为暂时性结构，如分裂细胞的纺锤体微管，也有相对稳定结构的，如鞭毛内的轴丝微管等。微管由微管蛋白亚基组装而成。微管的荧光标记也可利用与微管能够特异性结合的一些试剂以及微管结合蛋白。

紫杉醇能够特异性与微管结合，促进微管的组装，阻止稀释、钙离子浓度、低温等引起的微管的去组装。经过紫杉醇处理的细胞会停留在G2期和M期[6]。常见的紫杉醇荧光衍生物有Oregon Green 488 paclitaxel，BODIPY FL paclitaxel 和BODIPY 564/570 paclitaxel。这些探针都可用于微管形成和运动的研究。Oregon Green 488 paclitaxel为标记活细胞微管的一个重要探针，荧光标记物结合在紫杉醇7β-羟基位，可以选择性地与微管结合，在37°C时有高亲和力。而BODIPY FL paclitaxel 和BODIPY 564/570 paclitaxel在大多情况下并不适合用作活细胞探针。

陈春英[7]团队利用上述细胞骨架荧光标记方法，用Hoechst 33342和Oregon Green 488 Taxol对活细胞进行标记，追踪探究不同尺寸不同电荷的纳米材料对正常细胞和肿瘤细胞有丝分裂的影响，为纳米材料的安全性问题提供了答案，同时也为纳米材料的优化提供了方向。

图3[7] 聚苯乙烯纳米颗粒和tubulin在HeLa细胞有丝分裂不同时期的共定位情况。对活细胞进行标记，NH2ePS 纳米颗粒（橙色），tubulin (Oregon Green 488Taxol，绿色)，nuclei (Hoechst 33342，蓝色)。Scale bar: 10μm。

秋水仙碱也可以特异性地与微管蛋白结合，抑制微管蛋白的组装。

DCVJ探针(4-(dicyanovinyl) julolidine)[8]，与微管二聚体的一个特异性位点结合，可以作为追踪活细胞内微管蛋白聚合的有效探针。DCVJ在活细胞内的染色会被细胞松弛素D所阻断，因而能够用于活细胞内微管蛋白的多聚化研究。

Bis-ANS是体外研究微管组装的一个很好用的探针[9]。Bis-ANS是微管蛋白的抑制剂，与微管蛋白的疏水区结合力强。结合位点在对微管组装非常重要的接合区附近，远离抑制有丝分裂药物的结合位点，与秋水仙素和长春花碱等的结合位点不同。结合后有非常显著的荧光增强现象。

这些对微管有特异性结合试剂都可以标记上荧光素做成荧光探针用于微管蛋白的研究。

DAPI除了作为核酸染料外，还可在体外作为微管蛋白的荧光探针[10]。而DAPI与微管蛋白的结合位点与紫杉醇、秋水仙碱以及长春花碱都不同，结合后DAPI的吸收光谱会发生变化，荧光也会增强。DAPI与微管蛋白聚合体的亲和力为与二聚体的数倍，这使得DAPI可以用来追踪微管组装动力学过程。

当然，我们也可以对微管蛋白结合蛋白进行荧光标记，包括肌动蛋白素、黏着斑蛋白、踝蛋白等。

（更多细胞骨架荧光标记技术精彩内容，敬请期待下期）

[1]Vicente-Manzanares, M. and F. Sanchez-Madrid (2004). "Role of thecytoskeleton during leukocyte responses." Nat Rev Immunol 4(2): 110-122.

[2]Heath,G. R., et al. (2014). "Self-assembly of actin scaffolds on lipidmicrobubbles." Soft Matter 10(5): 694-700.

[3]Lengsfeld, A. M., et al. (1974). "Interaction of Phalloidin withActin." Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 71(7): 2803-2807.

[4]Heacock, C. S. and J. R. Bamburg (1983). "The quantitation of G- andF-actin in cultured cells." Anal Biochem 135(1): 22-36.

[5]Irving,A. T., et al. (2012). "Regulation of actin dynamics by protein kinase Rcontrol of gelsolin enforces basal innate immune defense." Immunity 36(5):795-806.

[6]Fuchs, D. A. and R. K. Johnson (1978). "Cytologic evidence that taxol, anantineoplastic agent from Taxus brevifolia, acts as a mitotic spindlepoison." Cancer Treat Rep 62(8): 1219-1222.

[7]Liu,Y., et al. (2011). "Intracellular dynamics of cationic and anionicpolystyrene nanoparticles without direct interaction with mitotic spindle andchromosomes." Biomaterials 32(32): 8291-8303.

[8]Kung, C. E. and J. K. Reed (1989). "Fluorescent molecular rotors: a newclass of probes for tubulin structure and assembly." Biochemistry 28(16):6678-6686.

[9]Horowitz, P., et al. (1984). "Bis(1,8-anilinonaphthalenesulfonate). A noveland potent inhibitor of microtubule assembly." J Biol Chem 259(23):14647-14650.

[10]Bonne, D., et al. (1985). "4',6-Diamidino-2-phenylindole, afluorescent probe for tubulin and microtubules." J Biol Chem 260(5):2819-2825.

本文若需引用或转载，请联系我们，注明源自徕卡显微系统，并保留徕卡显微系统及原作者相关版权信息。