使用ionKey/MS系统优化人血浆中缓激肽的SPE LC-MS/MS定量检测方法

对多肽类物质进行稳定、灵敏分析的需求是色谱分离和质谱测定的共同挑战。常见的肽通常难以通过LC-MS/MS进行分析，这是因为其不易离子化以及不易产生理想的碎片离子而导致MS灵敏度较低，从而使得LC和样品制备方法开发非常困难。由于缓激肽在血浆中的浓度低至pg/mL水平且代谢速度快，在采血和样品制备过程中还可通过蛋白水解人为生成，因此对其进行准确定量相当困难。

在本实验中，使用ionKey/MS系统更新了整个LC-MS平台，把UPLC分析集成到质谱源中。这种技术可显著提高灵敏度，是肽分析的理想方法。大多数生物分析LC-MS/MS方法常常消耗大量的溶剂和样品，从而增加了分析的成本和限制了可重复分析次数。除灵敏度增加外，ionKey/MS减少溶剂和样品耗量，提供足够的样品进行重复进样，更好的满足ISR测试需求。

应用优势

• 样品量减少2倍、灵敏度提升10倍，可以方便进行样品的多次进样，更好的满足ISR重复分析需求。

• 溶剂耗量减少50倍，节省分析成本。

• 采用混合模式SPE，可以减少基质干扰，增强在血浆中缓激肽萃取的选择性。

• Oasis µElution96孔板可浓缩样品，并在最大程度上减少肽损失，使血浆中缓激肽的检测限达到5 pg/mL。

• 选择性高的快速SPE提取（<30分钟）省去了耗时的免疫亲和纯化步骤。

本研究利用专门设计的血液采集技术以抑制离体外缓激肽形成，利用混合模式固样萃取法（SPE），使用新型高效ionKey/MS系统，实现缓激肽的高选择性、高灵敏度测定工作。相对于2.1mm直径色谱方法，ionKey/MS系统可获得更高灵敏度，这使得血浆使用量减少2倍，信噪比增加7-10倍（S:N）。因此，我们可以准确和精密地进行2.5 pg/mL缓激肽定量研究。

样品制备

血液采集

人血浆是从一例男性志愿者取得，血液收集在BD P100、P700、P800和血液采集管（仅含K2EDTA）中。这几种BD P血液采集管含有各种专利稳定剂/抑制剂的混合物，能在血液采集过程中即时溶解，使得人血浆中的蛋白和肽类物质得以保存。

样品预处理

加入内标（IS）［Lys-des-Arg9］- 缓激肽（5 ng/mL）10 µL至100 µL人血浆中，混匀。然后，样品用5% NH4OH水溶液以1:1比例稀释，混匀。

样品萃取

按下图方案，进行血浆样品的预处理。所有溶液都按体积比配制。对含有样品的µElution板的所有孔都应用所有萃取步骤。

结果和讨论

质谱

缓激肽的3+前体（m/z 354.18）和IS（344.94）用于定量。选择m/z 419.18 y31+的碎片作为缓激肽定量分析的主要片段，而m/z 408.18 b41+片段用于确证目的。关于IS，选择m/z 386.03 b72+碎片进行监测。虽然许多肽产生低于m/z 200的大量丰度好的碎片，但这些离子（常常是铵离子）易产生较高背景干扰，因为它们缺乏特异性。在该分析中，使用高度特异性的b或y离子碎片（其m/z值高于它们的前体），获得显著改善的方法特异性，为LC和SPE方法建立提供了便利。

色谱分离

缓激肽及其IS色谱分离，是通过微流控色谱分离装置（iKey）实现的。这种iKey具有UPLC级、亚2 µm颗粒填料，它可以在高压下操作，获得高效的LC分离。通过微流液相部件集成，可以避免毛细管连接有关的问题，包括人为因素、漏液和死体积。与分析规模（2.1 mm 内径）LC-MS分析进行比较，使用BEH C18，300 Å，1.7 µm，150 µm x 50 mm iKey可获得极好的峰形、峰高增加、改善的S:N。运用多维色谱法（特别是捕集器和反冲洗策略），可获得进一步的清洁样品，方便装载高有机相SPE洗脱液10 µL（维持肽类溶解度所要求的）而不发生分析物过载。此外，通常分析级色谱进样量（如10 µL）应用到iKey上，可获得灵敏度的显著增加；有利于复杂基质中准确、可靠的检测较低pg/mL水平的肽和蛋白。

使用ionKey/MS系统增加灵敏度运用ionKey/MS可方便血浆中缓激肽的高效LC分离方法的开发，其灵敏度和S:N比采用2.1 mm内径色谱法显著提高。200 µL的血浆萃取后，洗脱液用水以1:1比例稀释。取该样品3 µL进样到iKey，与同一样品在2.1 mm级的10 µL进样比较，可获得S:N的5倍改善。iKey离子化效率改善和灵敏度增加，使进样体积显著下降。采用ionKey/MS系统，可以以更小的进样体积（1-3 µL）获得相当或更高的灵敏度；当样品受限制或需要多次进样以符合ISR标准时，这种技术是理想的选择。

经优化的方法使需要的血浆样品减少一半，且洗脱液稀释比增加至1:2，它们二者可以尽量减少基质干扰。采用ionKey/MS和传统分析系统（ACQUITY UPLC及Xevo TQ-S＋UNIFI），进行萃取血浆10 µL进样（优化后方法）比较，采用ionKey/MS获得10倍信号增加和7倍S:N增加。这种改善如下图所示，附有缓激肽内源性水平比较。最终，使用150 µm iKey建立缓激肽的低流速MRM测定方法，该方法只需要100 µL血浆即可达到检测限度2.5 pg/mL。

从人血浆（100 µL）萃取的内源性水平缓激肽的比较：iKey（150 µm内径）对比传统分析流程（2.1 mm内径）。

样品配制

Oasis WCX SPE可提供反相和离子交换保留模式，帮助获得更好的样品纯度、选择性和提升灵敏度。此外，96孔Oasis µElution板可以在30分钟内进行人工处理，与大多数自动液相处理系统兼容，符合样品通量要求。这种格式也提供了非常小量（仅为50 µL）洗脱的能力，可以尽量减少在蒸发过程中发生的（由于吸附在采集板上引起的）肽损失可能性和/或化学不稳定性。

分析前处理和内源性缓激肽水平的评估

血浆中缓激肽的准确定量是特别困难的，因为它代谢迅速（其半衰期小于30秒），且在血液抽样和样品配制过程中可通过蛋白水解过程而人为产生。要评估缓激肽在血液中的最佳保存方法，以及预防缓激肽离体外形成，要特别注意血液采集的方案；这种方案采用市售血液采集管，其中含专利添加剂，这种添加剂可改善血浆分析物的回收率。

使用RADAR与MRM数据同步采集的尿液水解样品全扫描数据（A）。3.79分钟的全扫描峰为N-去甲基米氮平，6.47分钟为去甲西酞普兰，7.42分钟为赛洛唑啉，这些化合物目前尚未包含在此目标性MRM方法中。

结论

采用ionKey/MS系统、混合模式SPE和更m/z b或y离子碎片，能获得更好的选择性和灵敏度，可以准确地定量缓激肽和鉴别浓度的细微差异。本实验使用100 µL血浆，可获得优于分析级别LC-MS（它采用两倍多的样品）得到的灵敏度和S:N。使用150 µm iKey，建立了高度灵敏、低流量的缓激肽MRM定量方法。该法可以在基础水平缓激肽基础上，区分2.5 pg/mL范围内的微小变化。在2.5-8,000 pg/mL范围，标准曲线是准确的和精密的。所有水平的QC样品，符合推荐的FDA推荐标准，平均准确度介于92.7-104.0范围和平均%CV介于1.2-4.31范围，表明该方法是准确的、精密的和可重现的。此外，与常规分析流速方法比较，这种肽以相同体积（10 µL）的样品进样，可获得>10X的灵敏度增加。

ionKey/MS系统除获得优于2.1 mm直径规模的灵敏度以外，它也可以减少溶剂和样品耗量，从而减少成本，且可以进行样品的多次进样，获得改善的准确度或满足ISR重复分析要求。本研究也表明采用适当抑制剂（获得在血浆中缓激肽的稳定/保存）进行适当样品采集的重要性，以便准确地测定内源性水平。如果作进一步的验证，采用ionKey/MS系统为PK和临床研究中缓激肽准确测定奠定了基础。

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