蛋白质/多肽类药物N端测序-助力生物技术药物质量评价

导读

2017年全球医药行业销售前10名的药物中有7种是蛋白质类药物。蛋白质类药物的生物合成起始于N端，其N端氨基酸序列的组成是药物质量均一性和仿制药一致性评价的重要依据。下面我们一起来了解下蛋白质N端测序的原理和过程。

岛津蛋白质测序仪PPSQ-51/53A

蛋白质和多肽N端测序以Edman降解法为基础，主要反应过程包括偶合、切割、转化三步，最终形成稳定的氨基酸衍生物，通过HPLC法进行鉴定。N端切割位置后的下一个氨基酸成为新的N端，进行下一轮反应。具体反应过程见下图。

应用Edman降解法进行N端测序的原理

1）如果样品简单，含盐量量较低，我们将样品直接转移到玻璃纤维膜或PVDF（聚偏氟乙烯）膜上就可以测序了。

2）但若您分析的是含盐量高或含较多蛋白质稳定剂等成分的蛋白质样品，比如重组人粒细胞生长因子注射液原液等，直接上机可能会损害仪器，需要对样品进行脱盐后才能上机分析。不知大家现在都采用的什么样的脱盐方法呢？是费时费力的超滤管超滤除盐还是使用昂贵的脱盐小柱？这里给大家介绍一种简单的蛋白质脱盐方法，便宜又好用。

工具：PVDF膜、13 mm可换膜针式过滤头、注射器、EP管，组装自制脱盐装置，见下图。

使用方法：将样品稀释后加入装有经甲醇活化的PVDF膜的过滤头内，加入0.1% TFA清洗三次，即可完成脱盐。剪切小膜就可以上机测序了，是不是很方便呢？！

自制蛋白质脱盐装置

3）抗体类药物因含重、轻链，需要先通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离重链和轻链后，再切取目标条带测序。流程如下：

抗体类药物前处理流程

1）PTH-氨基酸混合标准品

PTH-氨基酸混合标准品测试图谱

PPSQ-51/53A流动相采用等度洗脱分离苯乙内酰硫脲（PTH）-氨基酸，基线稳定，保留时间重复性好，同时流动相重复使用，降低了分析成本。

2）样品分析

常规样品

PPSQ-51/53A数据处理简单、方便，自动实现氨基酸序列推测生成分析报告，使用蛋白质测序仪的专用软件可以方便地进行序列分析所需色谱图的后期处理。

曲妥珠单抗重链N端氨基酸序列分析图谱示例

（N端理论序列Glu-Val-Gln-Leu-，图谱中的DTT、DMPTU、DPTU为反应副产物）

N-末端部分甲硫氨酸缺失样品

样品存在N-末端部分甲硫氨酸缺失，N-末端氨基酸不一致，担心结果不能正确判读（两条链）？请放心，PPSQ-51/53A采用SPD-M30A检测器，检测灵敏度高，分析稳定，除了氨基酸定性，根据信号峰的峰面积可以计算每种氨基酸的生成量，并可以据此粗略估计样品N端甲硫氨酸的缺失比例。

重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子N端氨基酸序列分析图谱示例

（N端理论序列(Met)-Ala-Pro-Ala-Arg-）

N端焦谷氨酸环化封闭类样品

N端焦谷氨酸环化封闭，测序没信号？下图帕尼单抗重链直接测序无氨基酸检出，但使用焦谷氨酸氨肽酶进行切焦谷氨酸处理后，样品就可以正常测序了。

帕尼单抗重链N端封闭氨基酸无检出

帕尼单抗重链切焦谷氨酸后测序检测到氨基酸信号峰

（N端理论序列Gln-Val-Gln-）

作为生物技术药物研发和质控管理中不可或缺的一环，PPSQ-51/53A以其卓越的性能持续服务于医药行业。想要了解更多，快来联系我们吧。

撰稿人 顿俊玲

微信ID：chinashimadzu

长按二维码关注中国岛津

— 更多精彩 —