显微课堂 | 克服显微镜成像移动斑马鱼幼虫时的挑战

2026-04-14 10:20:56, 徕卡显微系统徕卡显微系统(上海)贸易有限公司

在非固定的斑马鱼幼虫中捕捉三维信息或快速事件，如心跳，使用Mica

斑马鱼是一种有价值的模型生物，具有许多有益的特性。然而，成像整个生物体面临挑战，因为它并不是静止的。在这里，这个案例研究展示了如何在斑马鱼幼虫的静止期间进行成像，并在移动后轻松重新定位。Mica的无缝集成的宽场和共聚焦功能可以捕捉快速事件，如心跳，几乎没有标准宽场系统固有的失焦背景噪声。

鱼类研究中的成像挑战

尽管斑马鱼有许多优点，但在成像方面仍然存在一些挑战，特别是对于活体标本：

胚胎的大小：

斑马鱼胚胎可以生长到几百微米，这在使用现代标准显微镜时可能会很具挑战性，尤其是在需要高分辨率时。

活胚胎的运动：

活胚胎是自然移动的，这使得图像捕捉变得复杂。保持胚胎静止以进行成像而不限制其发育或行为仍然是一个挑战。

通过Mica克服成像障碍

Mica通过在运动等挑战性条件下实现高质量成像来解决这些挑战。本案例研究展示了Mica如何通过成像自由移动的斑马鱼幼虫的血流来克服一些障碍。血流通过两种荧光标记可视化：DsRed用于红细胞，eGFP用于血管。

寻找非固定幼虫

传统上，为了避免繁琐的重新定位过程，幼虫会被固定。Mica的“样本查找器”功能通过生成省时省力的孔板概览图来简化这一过程。对于更高倍数成像，导航就像在概览上点击位置或在Mica的完全集成导航工具中进行其他采集一样简单。如果幼虫移动，低倍数（1.6倍）的螺旋扫描可以快速定位它，从而允许切换回更高倍数（10到63倍）进行细节成像。

动态事件的延时成像

Mica支持多种成像模式，包括透射光和高对比度集成调制对比（IMC；兼容塑料底载体，视频1）成像以及宽场和共聚焦模式下的荧光成像。这种多样性使研究人员能够选择最适合其实验的成像模式。

使用水浸物镜进行长期高倍成像（在工作距离的范围内）可以得到自适应水镜的支持，以确保持续浸没。

视频1：使用集成调制对比（IMC）对斑马鱼幼虫中红细胞运动进行的延时成像。仅IMC就提供了足够的对比度来可视化动态事件，例如红细胞在血管中移动，使其成为观察无标记过程的理想选择。

宽场成像是捕捉快速、大规模事件的主要选择，但以下数据（视频2）清楚地表明，在某些限制条件下，共聚焦成像也可以实现可比的高帧率，但提供了更好的光学切片能力。Mica同时获取所有标签的能力消除了由于多个标签导致的帧率降低，并防止了时空不匹配。

视频2：使用宽场和共聚焦显微镜对斑马鱼心脏进行的比较成像。通过宽场（a）和共聚焦（b）显微镜对斑马鱼心脏的单个光学平面进行的时间推移成像。虽然宽场成像以每秒10帧（fps）的速度进行，低于其最大容量，但共聚焦设置经过优化以提高速度，以减少视场（FOV）和较低分辨率下以每秒23帧进行成像。青色表示血管，品红色表示红细胞。

体成像

视频3：斑马鱼幼虫的体积宽场成像。青色表示血管，品红色表示红细胞。

Mica 提供了一键切换模式的功能，直接在现场进行，无需将样本转移到新系统。这一能力使得可以使用最适合成像任务的模式。

视频4：宽场、THUNDER、共聚焦和LIGHTNING的比较。虽然宽场（a）成像速度快，并且已经揭示了许多细节，但由于该模式固有的失焦模糊，一些结构信息仍然隐藏。THUNDER（b）减少了失焦信息并增强了对比度。然而，共聚焦成像（c）提供了更优越的光学切片。通过使用LIGHTNING，共聚焦图像可能进一步改善。

结论

Mica是一个多功能且强大的成像系统，为使用斑马鱼作为模型生物的研究人员提供了几个关键好处，包括：