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全自动固相萃取-高效液相色谱法串联质谱测定 水中沙星类抗生素药物残留


领域:其他    样品:沙星类抗生素,喹诺酮    项目:药物残留    参考: 李建晴,冯小花,董川. 三种喹诺酮类药物滤纸表面延迟荧光法研究[J]. 光谱学与光谱分析.(2003).    

1.介绍

沙星类(Quinones,QNs)抗生素(图-1)是一类人工合成的新型杀菌性抗菌药物,具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性以及毒副作用小、价格低廉等特点,被大量用于治疗和预防水生动物疾病及促生长。但研究表明,所使用的抗生素仅20%~30%被鱼类吸收,大部分进入环境中,而这部分抗生素再次进入食物链,可能导致养殖环境中病菌耐药性的产生,导致二次污染。这不仅影响到水产养殖业的健康发展,而且还威胁着生态环境的安全。水样中残留喹诺酮类抗生素,通过饮用进入人体,可能对人体肝脏功能造成严重损伤。因此,建立水环境中这类药物的检测方法尤为重要。目前,喹诺酮类药物残留检测方法,主要包括HPLC-UV、HPLC-FD、HPLC-DVD、LC-MS/MS、LC-ESI-MS/MS,另外还有荧光光谱法、毛细管电泳法和酶联免疫法等。

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图-1. 16种沙星类抗生素的结构式

本实验选择MCX阳离子交换柱进行富集、净化,超高压液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)联用技术检测,建立了环境水样中高灵敏的分析方法,该方法有望应用于水产养殖中。

关键字:全自动固相萃取;高效液相色谱-串联质谱;抗生素

2.仪器、试剂以及耗材

Reeko Fotector Plus全自动固相萃取仪(睿科)

MCX 固相萃取柱(Oasis,200 mg/6 mL)

高效液相色谱:(HPLC)Agilent 1260,质谱检测器(MS)Agilent 6410

氮气吹干装置:Reeko AutoEVA-60全自动平行浓缩仪

甲醇,乙腈(TEDIA 色谱纯);甲酸,氨水(优级纯)。

3.样品制备与净化

3.1固相萃取净化条件

全自动固相萃取仪睿科Fotector Plus 60位
固相萃取柱MCX(Waters,200 mg/6 mL)
活化甲醇
淋洗pH=4.0 的甲酸水溶液
洗脱5%的氨水甲醇溶液

3.2 富集净化

依次用甲醇(10mL)和水(10mL)以5.0mL/min的速率活化/平衡和淋洗固相萃取柱,备用。取纯净水样200mL,如为加标样品,请加入标准品(100 µL,100 ppb),加入EDTA-MCIlvaine缓冲溶剂(50 mL,0.1 mol/L)调节水环境的pH为4,以5mL/min的速率经固相萃取小柱富集后;用甲酸水溶液(pH=4.0)10 mL以10 mL/min速率淋洗;气推后用10 mL的5%氨水甲醇以1.0mL/min的速率洗脱。收集的样品在25 ℃,5 psi条件下浓缩至近干,流动相乙腈-水溶液(10:90,v/v,0.1 %甲酸)定容至1.0mL,供LC/MS-MS分析。全自动固相萃取方法见图-2。

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图-2. Fotector Plus水中沙星抗生素固相萃取方法

4.液质检测条件

4.1 色谱柱条件

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4.2 MRM参数

表-1. 16种抗生素的串联质谱检测参数

16种抗生素的串联质谱检测参数.jpg

4.3 16种沙星类抗生素的保留时间谱图

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图-3. 16种喹诺酮标准物质的MRM色谱图(5 ng/mL,进样量10 µL)

5.样品测试

5.1基质效应验证

取纯净水样,按照上述的样品处理步骤后,氮吹至近干,加入标准使用液(1ppm,20 µL),定容成1mL,供LC/MS-MS检测。如果基质加标浓度准确,则可以直接用标准曲线对样品进行定量;如果不准确,请使用含有基质的工作曲线进行定量。

选择定量离子的峰面积作为纵坐标,浓度作为横坐标,做相关曲线,曲线为线性回归,各点权重相等,拟合出工作曲线,要求R2>0.99;此曲线两周需要重新配置一次。

5.2 样品基质加标测试

对桶装纯净水和生活废水进行加标实验,加标浓度为低浓度(25 ng/L)、中浓度(50 ng/L)和高浓度(100 ng/L),结果如表-2所示:除了恩诺沙星和司帕沙星在76.9%~79.4%外,大部分的加标回收率在82.5%~114.2 %之间,RSD 1.5%~16.6%。该方法能够实现对水样中16种喹诺酮抗生素进行检测。

表-2不同水样的加标回收率

不同水样的加标回收率.jpg

5.3 不同类型固相萃取柱对沙星类化合物的富集效果

取纯净水为样品,加标的质量浓度分别为50 ng/L,按照上述方法,进行4平行样测定,考察该方法的不同固相萃取柱的回收率和重现性,分析结果如图-4所示:纯净水中抗生素的平均回收率分布在65.00%-91.38%(HLB),71.21%-152.28%(MAX)和77.41 % -123.21 %(MCX)。HLB回收率普遍偏低,MAX柱中沙星的回收率偏高,培氟沙星和氧氟沙星的回收率均超过了140 %,而且MAX柱需要在水样中加入氢氧化钠,容易造成水样中金属离子的水解沉淀,容易造成管路的堵塞。相比之下MCX柱的平行性比HLB柱和MAX好,回收率大部分在90 %-110%之间,除了恩诺沙星回收率偏低,只有77.41 %。

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图-4. 三种柱子的回收率对比

6. 结果与讨论

6.1 对于16种沙星类化合物在水中的富集方法,应考虑实验过程中基质对化合物检测的干扰。此步的干扰不仅来自于水样中杂质干扰,同时商业化的固相萃取小柱,使用的色谱级溶液等等都存在干扰杂质,因此需要进行基质效应确认,以避免前处理富集过程中存在基质效应。

6.2 氮吹浓缩过程中应控制吹干程度,不可过分干燥。

6.3 对于沙星类的两性化合物,在pH=7.0左右时,主要以带负电荷的形式存在水溶液中,此时进行富集,固相小柱无法对目标物进行吸附。因此需要进行pH调节至4.0左右,使其成为带铵根的正离子,利于下一步进行阳离子交换柱富集。

6.4 淋洗时采用甲酸酸化的水溶液,利于将固相萃取小柱中残留的EDTA除去,避免其在后续的洗脱液中干扰沙星类化合物的检测。



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