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【实验目的】通过不同的实验方法,检测药物对细胞凋亡的影响。
【实验内容】
(1)琼脂糖凝胶电泳检测DNA ladder。
(2)Western blot 检测凋亡蛋白酶底物PARP的剪切。
【实验方法】分述如下:
1、DNA Ladder
原理
细胞核染色质DNA 断裂是细胞凋亡的标志特征。在细胞发生凋亡时,核酸内切酶被激活,选择性降解染色质DNA,形成50-300 kbp 的大片段,并进而在核小体连接处断裂,形成180-200 bp 或其整倍数的DNA片段,这些DNA 片段可从细胞中提取出来,通过琼脂糖凝胶电泳,溴化乙***染色呈现为梯状条带(DNA Ladder),并据此判断细胞凋亡产生。
结果判断
核DNA进行琼脂糖凝胶电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder特征;相比之下,正常细胞的DNA不降解,电泳条带表现为一大分子片段,如下图所示,1、2、3、4条带分别为4个不同的化合物诱导细胞产生的DNA ladder 照片。
2、PARP蛋白剪切的测定
聚(腺苷二***酸-核糖)多聚酶(PARP)为一种依赖Zn2+ 的真核DNA结合蛋白,可特异性地识别DNA断裂末端并结合,是一种重要的DNA修复酶。在细胞凋亡发生的早期, PARP是caspase家族(如caspase3 和caspase7)的作用底物,后者可使PARP的DNA 修复功能丧失。Caspase可将 113kD的PARP水解为89kD和24kD的两个片断。本方法主要
是运用抗PARP抗体,用蛋白印迹法(western blotting)检测PARP 89kD的裂解片断以及113kD完整的PARP蛋白,以作为细胞凋亡早期的标志物。可检测3x105 凋亡细胞的PARP裂解片断。
显色反应的强弱与膜上条带PARP含量成正比,如下图所示,化合物A能诱导PARP剪切。
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