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心肌细胞培养
原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型,被广泛应用于心血管研究之中,我中心拥有专业的细胞培养技术平台,为客户提供心肌培养技术服务。实验步骤小鼠心肌细胞培养过程: 1. 把两个5ml注射器分别插入DMEM和胰酶中,分别向两个圆皿中加入5ml的DMEM培养液。用一把大镊子从鼠盆里取出一只生后2~3天的SD大鼠,放入0.1%新洁尔灭浸泡一下后拿出放在泡沫板上,用针头把鼠固定(位置摆正),用另一把大镊子取***酒棉球擦皮肤,再用酒精棉球脱***,取一把小剪子及小镊子开皮,充分撕拉开,再用酒精棉球消毒,后换另一把小剪子和镊子在剑突处正中线稍偏左开胸取心。2. 取出的心放在刚才准备的一个装有DMEM的圆皿中再取下一只。重复以上过程。(鼠全部杀死后,把取鼠镊及泡沫板、新洁尔灭缸等拿出台面。消毒、清洁,铺纱布、换手套。3.用第三副剪子和镊子把圆皿中的心脏周边的血凝及纤维组织剔除掉,放在另一个预先装好DMEM的圆皿中。抽取5ml的胰酶,然后将其中少许放入50ml的小烧杯中,大部分倒入三角烧瓶中。用第四副剪子将烧杯中的心脏剪成1mm3的碎块,倒入三角烧瓶中(可用剪刀刮入),再用剩余胰酶刷净烧杯。4.把温度计和三角烧杯放入250ml烧瓶中,(事先调好水量,多会没过三角烧杯,少温度会不均匀)。打开磁力搅拌器电源,调温度(使-缓慢加到34~35℃)和转速(转速不可过快,否则会打碎细胞,基本上标志为平行)。一定要注意***。5.温度达到34℃时开始计时,第一次为10分钟,以后可为8分钟,事情况而定。在此期间,在试管架上摆上5、6个离心管,标上1、1,2、2。其中在1号两管事先加入DMEM液各2毫升。6.10分钟后,把三角烧瓶取下,磁力搅拌器关上,用一个吸管轻轻吹打(使消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来),这个吸管(1)用后固定放在一个离心管中,以后每次消化后取下都用其吹打几下,第一次上清弃去,然后向两个1号管分别倒入2ml上清(尽量不要把组织倒出,也不要剩液太多,以免消化下的细胞重复消化造成损伤),用另一个吸管(2)混匀配平两个管(即两个管水平高度相同),轻轻吹打,以免损坏细胞。7.接着把这两个离心管放入离心机中,调10分钟,800或1000转,垫小锁,打开关。8.同时向三角烧瓶中加入5ml胰酶,继续消化8分钟,注意控制温度。此时向两个2号管中分别加入2mlDMEM液。9.取下三角烧瓶,仍用1号吸管吹打,后静置片刻向两个2号管分别倒入2毫升的上清,取出两个离心后的1号管,把上清液沿细胞贴壁一方慢慢倒掉,后向其中一管加入4ml的DMEM液,用2号吸管取少量液体加入另一个离心管中,把管底的沉淀细胞洗下来,把液体全部移入其中一管,三个管(1个1号管,两个2号管)配平,放入离心管中,离心十分钟。同时仍加5ml的胰酶,放入三角烧瓶中,继续消化(注意控制温度,达34℃时计时)。10.消化到4次左右,吹打均匀后,吸一滴滴在载玻片上,拿到镜下观察消化情况,决定消化次数。11.离心2次的吸管,放在试管架上,待离心过程全部完事后,把各管上清液倒掉,在各管加上3ml(不用精确,大致这样)DMEM液,记住共加入多少DMEM液的量,换吸管(3号)把各管底细胞块吸下吹打均匀后,移入50ml烧杯中,然后用注射器抽取余量的DMEM加入烧杯中,加入小牛血清及抗生素,换吸管(4号)吹打均匀。12.取出24孔培养板,一个人吹打,另一个人用加样器加药。封盖时过火,盖上盖,放在CO2孵箱。24小时后观察是否贴壁。(24孔板,每孔最多加2ml,一般加液时每孔加1~1.5ml)
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