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肝细胞培养
初代组织块培养: 取新鲜肝脏,先剥除被膜和血管等纤维成分,用刀或剪刀把肝脏剪成1mm3 左右的小块,采用帖壁培养法。初代消化法培养: 1.把肝组织切成2~4 立方毫米的小块,用不含钙镁的BSS 液洗两次。2.移入1:1 的0.1%胰蛋白酶和0.1%胶原酶(都用无钙镁BSS 配置)中,4℃冷消化10~12 小时后,通过250 微米和64 微米尼龙网或不锈钢纱网滤过。3.收集细胞、BSS 液洗1~2 次、计数、接种培养。消化培养肝细胞的另一种方法是灌流法(肝脏灌流需用全肝,以较小动物如小鼠和大鼠为好): 1.无菌解剖动物,取出肝脏,先用BSS 洗除血污。2.取5ml 注射器一支,吸取消化液后,把注射器头轻轻插入肝管中,用线绳结扎牢固,以防消化液漏出,轻轻把消化液注入肝管系统,并不时轻揉压肝脏,以便消化液进入肝小叶中;消化液在肝内停留20~30 分后,在吸出消化液的同时并轻揉压肝脏,以使肝细胞脱落和消化液吸出。3.待吸净消化液后,注入离心管中,低速离心分离,用RPMI 1640 培养基培养(较其它培养基为好),能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果。传代培养: 待细胞生长连接成片后,用BSS 洗一二次,加1:1 的0.025%胰蛋白酶和0.02% EDTA 混合消化3~5 分钟,待细胞回缩,便停止消化,弃掉消化液,用BSS洗一二次,注入营养液,吹打,制成细胞悬液,再接种培养。
无菌操作的注意事项:
细胞原代培养一定要保持工作区的无菌清洁,先用紫外灯杀菌1h,操作前用75%乙醇消毒,穿上实验服,戴上口罩和帽子,操作时不能大声说话,双手戴上一次性橡胶手套,整个无菌操作都应该在酒精灯的周围进行。
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