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采用实时荧光PCR技术,针对阪崎肠杆菌特异性基因设计引物和探针。PCR扩增过程中,与模板结合的探针被Taq酶分解产生荧光信号,荧光定量PCR仪根据检测到的荧光信号绘制出实时扩增曲线,从而实现阪崎肠杆菌在核酸水平上的定性检测。
1、样品处理
1)按照GB 4789.40-2016,取样品100g(mL),加入到含有900mL预热到44℃ BPW的无菌容器中均质,调节pH至6.8±0.2。
2)36±1℃培养18-24h。
注:也可参考其他地方标准进行样品的前处理。
2、核酸提取
1)取40μL增菌液于裂解液管中,98℃或沸水浴10min。
2)冷却至室温,吸取上清备用或者置于-20℃保存。
3、反应体系配置
从试剂盒中取出ES预混液,充分融化,短暂离心,然后将阴性对照、样品的DNA提取液、阳性对照各取5μL分别加入PCR管中,盖好管盖,短暂离心,立即进行PCR扩增反应。
4、PCR扩增
PCR管或PCR板置于PCR仪上,推荐反应程序设定如下:反应体系为25μL,在第二步每个循环60℃时检测荧光信号,检测通道选择FAM。
第一步
第二步
1次
45个循环
95℃
60℃√
72℃
5 min
15 s
30 s√
30 s
注:使用ABI系列PCR仪器,如果不添加ROX,“passive reference”和 “quencher”均选择“none”。
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