含血清培养上清能直接做分泌组蛋白质组学吗？

含血清培养上清可用于蛋白质组学质谱分析，直接开展分泌组研究需重点评估血清背景的影响。血清中的高丰度外源蛋白会扩大样本动态范围，影响低丰度细胞分泌蛋白的鉴定与定量，并增加蛋白来源判定的难度。

无血清收样同样需要结合细胞状态评估。部分细胞对培养条件变化较为敏感，撤除血清可能引起细胞状态改变、损伤及胞内蛋白释放，干扰分泌蛋白分析。分泌组样本设计需兼顾外源蛋白背景与细胞状态，根据细胞类型、培养条件和研究目的确定收样策略。

一、含血清培养上清直接分析存在哪些限制

1、高丰度血清蛋白影响低丰度分泌蛋白检测

白蛋白、免疫球蛋白等血清蛋白进入培养上清后，往往构成样本中的主要高丰度成分。质谱采集面对整个肽段混合物，高丰度肽段占据较多检测资源，低丰度细胞来源蛋白获得的有效碎片信息可能减少。

以细胞因子、胞外信号蛋白或其他低丰度分泌蛋白为研究目标时，血清背景会直接影响鉴定深度和定量稳定性。样本是否含血清，关系到后续能够获得多少具有解释价值的细胞来源蛋白证据。

2、数据过滤不能替代前端背景控制

异种血清培养体系中，部分蛋白可以通过物种特异肽段区分来源，保守蛋白仍可能存在共享肽段。物种数据库能够帮助整理鉴定结果，却无法改变质谱采集阶段已经发生的高丰度背景干扰。

后期删除血清来源蛋白，只能减少结果表中的外源蛋白条目。低丰度肽段在采集阶段缺少充分质谱证据的问题，无法通过数据库过滤补偿。

二、无血清收样是否更适合分泌组研究

1、无血清条件有利于降低外源蛋白背景

在细胞能够保持稳定状态的前提下，无血清或低外源蛋白培养条件可减少培养基来源蛋白进入上清，为低丰度细胞来源蛋白分析保留更大的检测空间。

收样条件并不存在统一方案。培养基组成、洗涤方式和收样时间均应根据细胞类型、实验处理和研究终点调整，重点是获得背景较低且能够真实反映目标生物学状态的上清样本。

2、细胞状态异常会降低分泌组结果的解释价值

部分原代细胞或培养条件依赖性较强的细胞，在血清撤除后可能出现应激、膜完整性下降或细胞死亡。胞内蛋白释放进入培养上清后，质谱结果中会出现更多非分泌来源蛋白。

低血清背景并不等同于高质量分泌组样本。细胞状态稳定、胞内蛋白释放得到控制，往往比单纯追求无血清条件更重要。

图1

三、含血清培养条件下如何设计分泌组分析

1、设置匹配的培养基空白

培养基空白应尽量保持与实验组一致的培养基组成、血清来源和前处理条件。空白样本能够提供培养体系自身的蛋白背景信息，帮助识别并排除明显的外源成分。

实验组中某个蛋白高于培养基空白，只能说明其丰度发生变化，不能单独证明其属于细胞主动分泌蛋白。蛋白来源仍需结合细胞状态、生物学定位和实验处理进行解释。

2、根据研究目标选择样本前处理

含血清上清可考虑高丰度蛋白去除、蛋白分级、浓缩、脱盐或其他净化策略。不同前处理方式对蛋白回收范围和定量一致性的影响不同，方案选择应围绕目标蛋白性质和分析目的展开。

高丰度蛋白去除过程中可能伴随部分结合蛋白损失。评价前处理效果不能只看总蛋白减少程度，还要关注目标蛋白保留、组间一致性和后续定量需求。

3、评估胞内蛋白释放情况

培养上清中出现较多胞内蛋白时，应检查细胞形态、培养状态和实验处理是否伴随明显损伤。细胞裂解释放会改变培养上清的蛋白组成，也容易把非分泌来源变化误判为分泌调控。

分泌组分析关注的不只是蛋白是否出现在胞外环境，还要判断其进入上清的可能来源。

四、分泌组与培养上清蛋白组的研究重点不同

1、分泌组分析强调细胞来源证据

以分泌因子、胞外信号蛋白、分泌酶或潜在分泌标志物为研究对象时，结果解释应关注蛋白来源。培养上清中检出某种蛋白，只能证明该蛋白存在于胞外样本中，不能单独证明其由细胞主动分泌。

血清背景、细胞损伤、蛋白亚细胞定位以及组间变化趋势均可作为来源判断的辅助信息。研究结论应建立在多方面证据一致的基础上。

图2

2、整体上清变化可按培养上清蛋白组设计

部分项目关注处理前后胞外蛋白环境的整体变化，并不要求所有检测蛋白都属于经典分泌蛋白。含血清培养上清可以开展蛋白质组学比较，但分析目标更接近培养上清蛋白组，而不是严格意义上的分泌组。

项目设计应把培养背景一致性、组间可比性和差异蛋白来源纳入结果解释。文章或研究结论中也应区分“培养上清中检测到的蛋白”和“具有分泌来源证据的蛋白”。

含血清培养上清开展分泌组蛋白质组学分析，关键在于控制高丰度血清背景并明确蛋白来源。收样条件、高丰度蛋白处理方式及空白对照设置应结合细胞状态和研究目标综合设计，以减少外源蛋白和细胞损伤释放对结果解释的干扰。

百泰派克生物科技可提供分泌组蛋白质组学及培养上清蛋白组检测与分析服务；对于含血清培养上清，可根据细胞类型、培养条件和目标蛋白特点评估收样及前处理方案，为后续质谱分析提供适配的项目设计。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

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北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

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