蛋白质的定量分析中Label-free、TMT与PRM适用差异

蛋白质的定量分析是蛋白组学研究中用于比较蛋白表达差异、筛选候选标志物和验证关键通路蛋白的重要技术环节。Label-free、TMT与PRM均依托质谱平台完成蛋白或肽段定量，但三者并不是同一类问题下的简单替代关系，而是在研究阶段、样本组织方式、数据覆盖范围和结果用途上具有不同适用侧重。在实际项目中，选择定量蛋白组学路线时更应关注“当前实验要解决什么问题”。若目标是发现尽可能多的差异蛋白，发现型策略更合适；若重点是多组样本的相对比较，标记定量路线需要优先评估；若已有候选蛋白并需要进一步确认变化趋势，靶向质谱检测更有针对性。

图1

一、蛋白质定量路线选择的核心判断依据

1、研究阶段

(1) 发现阶段

发现阶段通常需要获得较广泛的蛋白表达信息，用于差异蛋白筛选和通路分析。Label-free和TMT均可用于发现型蛋白质的定量分析，具体选择需结合样本数量、分组方式和数据深度要求。

(2) 比较阶段

当研究涉及多个处理组、时间点或疾病分组时，定量路线需要支撑稳定的组间比较。TMT可通过同位素标记和混合检测设计减少部分上机批次差异带来的影响，适合分组结构较明确的项目。

(3) 验证阶段

当研究已获得候选蛋白列表，需要确认特定蛋白或肽段的变化趋势时，PRM靶向蛋白定量更适合用于结果验证。该路线更强调目标明确、肽段特异性和检测重复性。

2、样本与分组设计

(1) 样本数量

Label-free对样本扩展较灵活，适合样本量较大或分批收集的研究。此类项目应重视批次安排、质控样本设置和数据归一化，避免技术波动影响差异判断。

(2) 分组复杂度

TMT适合多组样本在同一标记体系中进行相对定量比较。若分组较多或需要跨批次设计，应提前评估样本均一性、通道安排和后续数据整合方式。

(3) 目标蛋白范围

PRM通常不作为大规模发现型筛选工具，更适合对已知候选蛋白进行靶向检测。前期需要明确目标蛋白、候选肽段及其与研究问题的对应关系。

3、结果用途

(1) 差异蛋白筛选

若研究重点是寻找潜在差异蛋白，Label-free和TMT均可作为发现型检测路线。Label-free更适合灵活扩展样本，TMT更适合结构明确的多组比较。

(2) 多组定量比较

若实验强调不同处理组之间的相对定量关系，TMT可作为重点评估方案。其结果解释仍需结合样本质量、标记状态和统计分析策略进行判断。

(3) 候选蛋白验证

若研究已进入候选蛋白验证阶段，PRM可围绕特异性肽段进行靶向检测，用于验证发现型蛋白组学结果，并为后续功能实验提供质谱证据。

二、Label-free、TMT与PRM的适用差异

1、Label-free定量蛋白组学

(1) 技术定位

Label-free不依赖同位素标记，主要根据质谱信号强度或相关定量特征进行相对定量。其流程相对直接，适用于探索性蛋白组学分析和大样本趋势比较。

(2) 适配条件

当样本数量较多、分批收集较常见，或项目处于差异蛋白初筛阶段时，Label-free具有较好的方案灵活性。对于复杂样本，应通过稳定的前处理和质控策略提高数据可比性。

(3) 设计风险

Label-free结果容易受到样本处理、上机顺序和仪器状态影响。实验设计中应关注随机化、批次平衡和数据标准化，避免将技术偏差误判为生物学差异。

2、TMT定量蛋白组学

(1) 技术定位

TMT通过同位素标签对不同样本肽段进行标记，再混合检测并完成多通道相对定量。该方法适合需要在统一分析体系内比较多个分组的蛋白组学项目。

(2) 适配条件

TMT适用于处理响应分析、疾病组与对照组比较、细胞或组织多组定量研究。若样本来源、蛋白量和分组设计较稳定，TMT路线通常更便于进行系统性组间比较。

(3) 设计风险

TMT对蛋白提取、酶解、标记反应和样本均一性有较高要求。若前处理差异较大，可能影响通道间比较和后续差异蛋白解释，因此送样前需评估体系兼容性。

3、PRM靶向蛋白定量

(1) 技术定位

PRM基于高分辨质谱对目标肽段进行靶向采集，更适合对已知蛋白或候选肽段进行定量检测。其优势在于目标清晰、结果解释集中。

(2) 适配条件

PRM常用于差异蛋白验证、候选标志物检测、通路关键蛋白确认和跨样本重复检测。若已有Label-free或TMT筛选结果，PRM可作为后续验证路线。

(3) 设计风险

PRM需要提前筛选特异性肽段，并评估肽段响应、样本基质和方法适配性。若目标肽段选择不合理，可能影响检测灵敏度和结果解释边界。

三、如何制定蛋白质的定量分析服务方案？

1、先明确研究目标

(1) 全局发现

若项目目标是获得蛋白表达谱并筛选差异蛋白，可优先评估Label-free或TMT路线。选择时应结合样本数量、分组结构和后续生物信息分析需求。

(2) 多组比较

若研究重点是比较多个实验组之间的蛋白表达变化，TMT可作为重点选择方向。方案设计应同步考虑通道安排、样本一致性和数据整合逻辑。

(3) 靶向验证

若已有候选蛋白、关键通路或潜在标志物，PRM更适合作为验证型检测方案，用于确认目标蛋白变化趋势并支持后续功能研究。

2、再评估样本条件

(1) 样本质量

样本浓度、蛋白完整性、杂质残留和基质复杂度会影响定量路线选择。不同样本类型应采用相匹配的前处理和质控策略。

(2) 分组结构

分组数量、重复设计、批次安排和样本来源一致性会影响Label-free、TMT与PRM的适用性。不能仅根据方法名称判断检测方案。

(3) 数据要求

若需要覆盖更多蛋白，应优先考虑发现型蛋白组学路线；若需要验证特定目标，则应采用PRM等靶向定量方法。

3、最后形成组合路线

(1) Label-free筛选

探索性研究可采用Label-free完成初步差异蛋白筛选，再结合功能富集和通路分析形成候选蛋白列表。

(2) TMT比较

分组明确且强调相对定量比较的项目，可采用TMT定量蛋白组学进行多组比较，并结合统计分析筛选差异蛋白。

(3) PRM验证

对于关键蛋白或候选标志物，可通过PRM靶向蛋白定量进行验证，形成从发现型筛选到靶向确认的检测闭环。

图2

蛋白质的定量分析应根据研究阶段、样本条件、分组设计和结果用途进行选择。Label-free更偏向灵活发现，TMT更适合多组相对定量比较，PRM更适合候选蛋白靶向验证。三种技术并非互相替代关系，也可根据项目进展组合使用。如需开展Label-free定量蛋白组学、TMT定量蛋白组学或PRM靶向蛋白定量分析，可提供样本类型、分组设计、研究目标和已有筛选结果。百泰派克生物科技可根据项目需求提供蛋白质的定量分析技术咨询、检测方案评估和服务支持！

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

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