产品介绍

英文名：His Pull-Down Kit (Agarose beads)

纯度：BioReagent, 即用型, for IP

货号：H1506146

存储温度：2-8°C储存,室温,-20°C储存,禁止冷冻

产品介绍：

His Pull down Kit是一款能够高效完成标签诱饵蛋白与靶蛋白共沉降的试剂盒。通过His标记的诱饵蛋白分离与纯化对应的未知捕获蛋白。简单的实验原理是：将His固定于琼脂糖凝胶上，形成His-琼脂糖凝胶；将诱饵蛋白与His融合表达，获得的His-诱饵蛋白融合蛋白可与His-琼脂糖凝胶结合；若环境中存在与诱饵蛋白互做的捕获蛋白，则会形成“琼脂糖凝胶-His-诱饵蛋白-捕获蛋白”复合物，那么与诱饵蛋白互做的捕获蛋白即可被分离并检测。

本产品由高品质的His标签蛋白琼脂糖凝胶是将 IDA 配基通过 9 个原子的间隔臂以醚键固定在高刚性琼脂糖基质上，然后螯合上金属离子 Ni2+而制备成的一种介质。高刚性琼脂糖基质具有高流速、低反压的特点。高刚性琼脂糖基质具有更优的孔道结构，赋予了其高于传统琼脂糖基质的载量。具备操作简便、结合能力强、适用范围广等优点。

注意事项

1. 本产品仅限于专业人员的科学研究使用。

2. 除非另有说明，所有操作建议于4°C下进行, 以尽量减少蛋白降解的可能性。若细胞裂解不够完全可在使用裂解液之后使用超声裂解细胞。

3. His标签蛋白纯化亲和层析介质应保存在储存溶液中，防止干燥，使用前请充分混匀。即颠倒若干次使凝胶混合均匀，混匀操作须轻柔，不宜剧烈涡旋震荡等，避免抗体变性等。

4. 经煮沸后的填料失去结合能力，经煮沸的填料不应再次使用。

5. 试剂用量可按实验实际进行取用，建议通过预实验进行免疫沉淀的验证或对裂解条件进行一定的调整。

6. 请注意安全事项，遵守实验室试剂操作规范操作。

7. 本试剂盒内包含的裂解液已包含蛋白酶抑制剂，如果有特殊需求，可考虑选择其它适当的抑制剂混合物。

8. 蛋白样品收集后宜尽快完成纯化工作，并应始终放置在4ºC或冰浴，以减缓蛋白降解或变性。

9. 在免疫沉淀或纯化时，建议设置阳性和阴性对照组。

使用方法 (除非另有说明，所有操作建议于4℃下进行)

1. 试剂准备

额外所需材料：

(1) 自备试剂：

a) 一抗：His tag 抗体。

b) 二抗：Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)、Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)。

c) 其它试剂：TBST、电泳液、转膜液、还原型 SDS-PAGE 凝胶以及蛋白互作所用诱饵蛋白、靶蛋白。

(2) 所需仪器：电泳仪、转膜仪、成像仪。

以上试剂若有需求，可以订购阿拉丁的His tag (C-terminal) Mouse mAb ( Ab155835)、Recombinant His tag Antibody ( Ab086830)、Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) ( Ab176443)、Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) (Ab179001)。

2. 溶液配制

可使用试剂盒准备的缓冲液，也可根据实际情况配制不同的缓冲液体系。所有缓冲液在使用前建议用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤，缓冲液建议4°C保存，若试剂浑浊，请立即丢弃。

(1) 洗脱液配制：准备1mL 250mM咪唑。即取62.5 µL 4M咪唑，加入到937.5 µL的1×洗液中。

(2) 1× Lysis Buffer配制：按照每50-100万细胞使用100-200 μL含抑制剂裂解液用于裂解。将裂解液与蛋白酶抑制剂(100×)按照100:1的比例混合。例1 mL的裂解液中加入10 μL 蛋白酶抑制剂(100×)，即得1 mL含抑制剂裂解液。配制好的含抑制剂裂解液宜放置在冰浴或4 ºC暂存。

注1：含抑制剂裂解液宜现用现配，不宜配制后冻存并留作后续使用。

注2：该裂解液适用于哺乳动物细胞。

(3) 1×洗液配制：按照 9:1 的比例用去离子水将 10×洗液稀释待用。例如：1mL 10×洗液加入 9 mL 去离子水，混匀后即为1×洗液。

(4) 凝胶漂洗。轻轻重悬His标签蛋白纯化亲和层析介质，尽量形成均匀的凝胶悬浊液，按照通常每 40 μL混合均匀的凝胶悬浊液(以下亲和沉淀步骤中都以每样加入40 μL凝胶悬浊液为例)，取适量His标签蛋白纯化琼脂糖凝胶至一洁净离心管中，加入0.5 mL1×洗液，1250×g在4℃离心30秒，弃上清，重复此步骤2次。

注：使用大孔径吸头(如用剪刀剪去部分吸头)吸取凝胶悬浊液会比较方便。

3. 诱饵蛋白准备

(1) 对于大肠杆菌表达的His标签融合蛋白:

按照标准方案培养并转化大肠杆菌。取 5 mL 经 IPTG 诱导的大肠杆菌培养液，转移至无菌离心管中。5000×g 离心 5 分钟，弃去培养液上清。按每 5 mL 初始菌液体积加入 1 mL PBS 缓冲液重悬菌体沉淀，用移液枪吹打或涡旋混匀。取 1 mL 细胞悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。5000×g 离心 5 分钟，弃去上清。按每 5 mL 初始菌液体积加入 200 μL 预冷 PBS 缓冲液重悬沉淀，用移液枪吹打或涡旋混匀。可按需加入蛋白酶抑制剂；为获得最佳效果，制备细胞裂解液时建议使用蛋白酶抑制剂混合物。按每 5 mL 初始菌液体积加入 200 μL 亲和沉淀裂解缓冲液，立即颠倒离心管至充分混匀。冰上孵育约 30 分钟，期间定期颠倒离心管。12000×g 离心 5 分钟，使大肠杆菌粗裂解液澄清。将上清转移至另一支微量离心管，冰上保存，标记为诱饵蛋白裂解液。

(2) 对于分泌型His标签融合蛋白：

收集培养基上清，检测诱饵蛋白浓度。如果诱饵蛋白质浓度较高，建议用1×PBS稀释至蛋白质终浓度为500 μg/mL，以备后续实验。

(3) 对于已经纯化好的His标签融合蛋白

检测诱饵蛋白浓度。如果诱饵蛋白质浓度较高，建议用1×PBS稀释至蛋白质终浓度为500 μg/mL，以备后续实验。

注：如果诱饵蛋白中含有His，需要先通过透析或者超滤的方式去除，才可以进行后续实验步骤。

4. Pull-Down 检测

(1) 诱饵蛋白固定

1) 将步骤3得到的诱饵蛋白加入预洗好的凝胶中，轻柔混匀，在4°C摇床上孵育3 h。此处需保留部分诱饵蛋白样品，作为input对照，以备后续检测使用。

2) 离心分离。孵育结束后，1250×g在4°C离心30秒，将上清转移至新的离心管中，留样备检。

3) 将离心管中的复合物转移到离心柱中，1250×g在4°C离心30秒，转移离心液至新的离心管中，标记为诱饵蛋白流穿液，以备后续检测使用。

注：对于细胞或细菌裂解液，加入至少500 µLHis标记的融合蛋白裂解液。对于已纯化好的His标签融合蛋白，使用足够的体积以确保添加约100-150 µg的诱饵蛋白。

4) 向离心管中加入500 μL 1×PBS，倒置几次温和混匀，清洗凝胶，1250×g在4°C离心30秒，弃离心液。重复4次。得到诱饵蛋白-凝胶复合物。