Antarctic Phosphatase (Thermosensitive)，不含DNA外切酶和内切酶，不含RNA酶。

中文名：Antarctic Phosphatase (Thermosensitive)

英文名：Antarctic Phosphatase

纯度：不含DNA外切酶和内切酶，不含RNA酶。

货号：A743821

存储温度：-20°C储存

产品介绍：

阿拉丁生产的Antarctic Phosphatase (Thermosensitive)，是一种源自南极微生物的、热敏感的重组表达纯化的磷酸酶，可以催化去除DNA、RNA、dNTP、rNTP 5'或3’末端磷酸基团。DNA或RNA 5’端脱去磷酸基团(简称脱磷或去磷)后就不能被连接酶(ligase)所连接，常用于避免载体的自连、提高基因克隆时的阳性率、选择性连接特定序列等。Antarctic Phosphatase也可以脱去蛋白质丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上的磷酸基团。Antarctic Phosphatase是一种新型碱性磷酸酯酶，在阿拉丁的各种内切酶和PCR缓冲液中可保持不低于100%的活性，对于各种类型的DNA 5’末端的去磷酸化均可在37℃孵育15分钟即可完成，并且75℃孵育5分钟即可完全失活。碱性磷酸酶常被称作碱性磷酸酯酶，是一类水解酶，通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基。其去磷酸化作用的底物包括核苷酸、蛋白质和生物碱等，并在碱性条件下最为有效。该酶是一组同功酶的统称。常见的小牛肠碱性磷酸酶(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, CIAP/CIP)被广泛用于二抗等的标记，最终用于蛋白和核酸等的检测，也常用于DNA或RNA 5'和3'末端的去磷酸化(去单磷酸化)，特别是质粒的5'末端去磷酸化以避免质粒自连等。经限制性内切酶酶切的质粒5'端带有磷酸基团，在进行基因克隆时为避免质粒自连，可以使用Antarctic Phosphatase去除5'末端磷酸基团。脱去5'末端磷酸基团的质粒不能发生自连。

特点：

快速去磷酸化，只需37℃孵育15分钟即可；快速失活，75℃孵育5分钟即可完全失活；使用方便，在各种内切酶和PCR缓冲液中保持不低于100%的活性，可以和质粒DNA的酶切等同时进行；兼容性强，对于5'或3'突出末端、平端等各种DNA的脱磷酸化采用完全相同的操作步骤；", '适用于后续的连接反应，经Antarctic Phosphatase脱磷酸基团，并75℃孵育5分钟失活后，通过柱纯化或凝胶电泳后切胶回收纯化等适当处理后，可用于后续的连接反应。

用途：

通过去除载体或DNA片段5'末端的磷酸基团，防止载体或DNA片段自连；质粒DNA同时进行内切酶消化和脱磷；通过5'末端脱磷，制备用于T4 PNK进行5'末端标记的DNA或RNA；去除DNA、RNA、rNTP和dNTP的5'末端的磷酸基团；PCR产物中去除dNTP和焦磷酸根；用于蛋白质丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的去磷酸化。

来源：

大肠杆菌重组表达。Antarctic Phosphatase通常会形成同源二聚体，其单体的分子量为35kD。酶

酶储存溶液：

10mM Tris-HCl (pH7.4)，1mM MgCl2，0.1mM ZnCl2，50% (v/v) glycerol。Antarctic Phosphatase Reaction Buffer (10X):500mM Bis-Tris-Propane HCl，10mM MgCl2，1mM ZnCl2，pH 6.0。

失活或抑制：

75℃加热5分钟可使Antarctic Phosphatase充分失活。EDTA等金属离子螯合剂对Antarctic Phosphatase有抑制作用。阿拉丁生产的Antarctic Phosphatase75℃灭活前后的酶活对比(参见图1)。图1. 阿拉丁热敏碱性磷酸酶Antarctic Phosphatase 75℃灭活前后的酶活对比。以pNPP为底物进行比色法测定，灭活采用75℃加热处理5分钟。反应体系为：50µl底物缓冲液(10mM pNPP等)，2µl稀释125倍后的阿拉丁Antarctic Phosphatase (圆形和三角形图标分别代表是否经过75℃加热处理5分钟的酶)。混匀后室温反应20分钟，每隔1 min测定一次OD405。

注意事项：

Antarctic Phosphatase与其它碱性磷酸酶相同，其酶活性需要有Zn2+和Mg2+的存在。反应中加入1/10体积的Antarctic Phosphatase Reaction Buffer (10X)，能够提供足够的Zn2+和Mg2+等以保证酶的活性。Antarctic Phosphatase在NEB buffers 1、2、3、4和CutSmart缓冲液中时，必须同时加入Antarctic Phosphatase Reaction Buffer (10X)才有活性。Antarctic Phosphatase在单价盐离子存在时活性增强。Antarctic Phosphatase在EDTA等金属离子螯合剂、无机磷酸盐及磷酸盐类似物存在时，其活性被抑制。Antarctic Phosphatase在DTT、巯基乙醇等还原剂存在时，其活性会降低。本使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后该立即放置于-20℃保存。本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：

1. Antarctic Phosphatase在酶切反应中对质粒DNA 5'末端去磷酸化：a.参考如下表格设置去磷酸化反应：质粒DNA1µg内切酶的Reaction Buffer (10X)2µl补充无核酸酶的去离子水至19µl 内切酶1μlb.按上述体系设置好之后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀一下)，随后离心沉淀液体至管底。c.37℃孵育60分钟或根据内切酶说明书推荐的最适条件进行酶切反应。d.向酶切体系中加入1µl Antarctic Phosphatase (5U/µl)，37℃孵育15分钟。如果希望获取更好的去磷酸基团效果，也可以延长孵育时间至60分钟，但通常孵育15分钟已经足够。e.75℃加热5分钟，对Antarctic Phosphatase和限制性内切酶用热失活的方法终止反应。f.如果后续用于连接反应，可以使用适当的DNA纯化试剂盒纯化或DNA凝胶回收试剂盒(如D0056)进行凝胶电泳后的切胶回收纯化，也可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化已消化并且脱磷酸化的DNA或RNA。2.DNA、RNA的5'或3'末端脱磷a.参考如下表格设置去磷酸化反应： 待脱磷的DNA或RNA1-5µg (up to 10pmol termini)Antarctic Phosphatase Reaction Buffer (10X)2µl补充无核酸酶的去离子水至19µAntarctic Phosphatase (5U/μl)1μl b.按上述体系设置好之后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀一下)，随后离心沉淀液体至管底。c.37℃孵育15分钟。如果希望获取更好的去磷酸基团效果，也可以延长孵育时间至60分钟，但通常孵育15分钟已经足够。d.75℃加热5分钟失活Antarctic Phosphatase。e.后续如有必要，可以使用适当的DNA纯化试剂盒(如D0033)纯化或DNA凝胶回收试剂盒(如D0056)进行凝胶电泳后的切胶回收纯化，也可以使用酚氯仿抽提、乙醇沉淀等方法纯化已消化并且脱磷酸化的DNA或RNA。说明：上述脱磷反应可以用于5'突出的DNA，也可以用于平末端DNA，反应条件相同，即均为37℃孵育15分钟。3.蛋白去磷酸化a.参考如下表格设置去磷酸化反应：待去磷酸化的蛋白1¬-10µgAntarctic Phosphatase Reaction Buffer (10X)5µl补充去离子水至45µlAntarctic Phosphatase (5U/μl)5μl b.按上述体系设置好之后，轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀一下)，随后离心沉淀液体至管底。c.37℃孵育60分钟。d.加入EDTA至终浓度为50mM或加入钒酸钠至终浓度为10mM以终止去磷酸化反应。注意：酶的最佳用量和37℃的最佳孵育时间需根据特定蛋白自行进行优化。

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