慢病毒构建、包装、纯化、鉴定

一、实验流程
制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，四种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后8 h 更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,感染Hela细胞后定量PCR检测病毒滴度。体内和体外实验对慢病毒滴度的要求不同，生产过程中可以通过浓缩得到不同滴度的慢病毒颗粒。
 
二、 实验材料
1、慢病毒载体、包装细胞和菌株慢病毒载体系统（Tronolab）：
该病毒包装系统为四质粒系统，组成为pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G, 目的干扰质粒。其中目的干扰质粒能表达绿色荧光蛋白（GFP）. pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G含有病毒包装所必须的元件.
细胞株  293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。菌株  大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
 
2、主要试剂
 

试剂名称	生产厂家	货号
包装细胞293T细胞株	中科院上海细胞所
大肠杆菌菌株DH5α	Invitrogen公司
胎牛血清	Invitrogen公司
胰蛋白酶	Invitrogen公司
限制性内切酶	Fermentas
T4 DNA连接酶	NEB公司	M0202V
质粒DNA提取试剂盒	Axygen公司
制备感受态试剂盒	BIOSCIENCES
凝胶回收试剂盒	Qiagen公司
1kb/100bp ladder	Fermentas

 
3、主要仪器

仪器名称	生产厂家	货号
PCR仪	Applied Biosystems公司
电泳仪	Bio-rad公司
荧光倒置显微镜	奥林帕斯
冷冻超速离心机	Hitachi
细胞培养箱	healforce
凝胶成像仪稳压DNA电泳仪	Tianneng
恒温摇床
电热恒温培养箱
移液器	eppendorf
电热恒温水浴锅	上海一恒实验设备有限公司
数码凝胶处理系统	天能科学仪器
一次性平皿	Cell-star
烧瓶

三、慢病毒载体系统质粒基本信息和图谱
该病毒包装系统为四质粒系统，组成为pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G, 目的穿梭质粒。其中穿梭质粒（目的穿梭质粒）含有能表达绿色荧光蛋白（GFP）；pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G含有病毒包装所必须的元件。
 
四、 慢病毒生产实验步骤
1、慢病毒包装细胞转染用胰蛋白酶消化对数生长期的293 T细胞，细胞密度为0.5×10时；重新接种于25 mL的15cm细胞培养皿，37℃，50 mL/L CO2培养箱内培养；
2、制备慢病毒包装系统中四种质粒DNA溶液；
pRsv-REV      10 μg，
         pMDlg-pRRE      15 μg，
pMD2G       7.5 μg,
干扰质粒       20 ug
加入无菌水定容至1800 μL, 再加入CaCl₂ (2.5 mol/L) 溶液200 μL，混匀，加入2×BBS缓冲盐溶液2000 μL，室温放置20～30 min；
3、当细胞密度达60%～70%时转染. 将DNA和磷酸钙混合液转移至含单层细胞的培养液中，混匀，培养12 h后弃去含有转染混和物的培养液，加入PBS 15 mL，轻摇后弃去，重复该步骤3次.；
4、每瓶细胞中加入含100 mL/L小牛血清的细胞培养液15 mL，继续培养48 h.；
5、收集转染72 h的293T细胞上清液；
6、将收集的上清液于4℃，4000 g离心10 min，收集上清液；
7、将各种不同RNA干扰质粒上清液以0.45 μm滤器过滤；
8、于40 mL超速离心管中，4℃，25000 r/min离心20 min；
9、而后以冰PBS液，分别溶于500ul Dmem,和500ul PBS重旋病毒沉淀于4℃溶解过夜