病毒包装

Cyagen目前提供慢病毒、腺病毒、腺相关病毒载体构建与病毒包装服务。您可以根据实验需要，选择合适的病毒包装系统。 

一、慢病毒包装

赛业生物采用第3代重组慢病毒包装系统制备病毒颗粒。为了增加慢病毒的安全性能，病毒制备所必需的元件序列被拆分到4个质粒当中，分别是：

1）1个编码目的基因的慢病毒转移质粒。目的基因两侧各有一个LTR（long terminal repeat）序列，LTR序列促使目的基因整合到目的细胞基因组里。为了提高安全性能，转移质粒的3’ LTR缺失了部分序列，使得整合后的病毒基因组失去自我复制能力。
2）2个包装质粒。其中一个质粒编码Rev, 另外一个质粒编码Gag和Pol。
3）1个编码包膜蛋白的质粒。

利用上述质粒包装出来的重组慢病毒颗粒，被称为自我失活VSV-G假型慢病毒（self-inactivating VSV-G pseudotyped lentivirus）。

每次包装重组慢病毒，包装质粒和编码包膜蛋白的质粒都是固定不变的，变的是编码目的基因的转移质粒。因此，您需要设计的是转移质粒。登陆即可轻松快捷设计转移质粒！

首先将转移质粒、包装质粒和包膜蛋白质粒转染到293T细胞。更换新鲜的培养基后，继续培养48～72小时。收集培养液，进行离心浓缩后，就可得到转导细胞级别的病毒颗粒。如果您想获得注射动物级别的超纯病毒颗粒，可以利用蔗糖超速离心进一步去除杂质，从而获得纯度更高的病毒颗粒。

二、CRISPR慢病毒包装

CRISPR/Cas9慢病毒系统可对基因组的特定位点进行精确编辑。其原理是核酸内切酶Cas9蛋白通过导向性RNA(guide RNA,gRNA)识别特定基因组位点并对双链DNA进行切割，从而实现细胞水平单基因或多基因敲除。CRISPR慢病毒缩短实验周期的同时，更能快速得到实验结果，省时省力。

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三、腺病毒包装

赛业生物采用第1代重组腺病毒包装系统制备腺病毒颗粒。该包装系统包含一个腺病毒载体和一株包装细胞株。
1、一个腺病毒载体：缺失了E1和E3区域的腺病毒基因组序列被克隆到质粒上。
2、一株包装细胞株：E1基因片段被整合到293细胞。

野生型腺病毒基因组是一条约36kb的线性双链DNA（dsDNA）分子。基因组的两个末端被称为Inverted Terminal Repeat（ITR），末端之间含有腺病毒DNA复制所需基因。在病毒DNA复制周期早期表达的基因，称为早期基因，主要有4个，按表达先后顺序依次是E1、E2、E3、E4。在病毒DNA复制周期晚期表达的基因，称为晚期基因，主要有5个，按表达先后顺序依次为L1、L2、L3、L4、L5。为了制备出自我失活的重组腺病毒，E1基因会被删除，使重组腺病毒成为一种安全的基因运输工具。为了增加包装能力，E3基因也同时被删除，因为E3基因产物会提高宿主的免疫反应，而且对病毒生产不重要。缺失了E1和E3基因的腺病毒基因组序列被克隆到质粒上构建成腺病毒载体。E1基因片段被整合到293细胞基因组中，包装病毒颗粒时，Pacl消化的腺病毒载体转染到表达E1基因的293细胞。E1基因激活了其他早期基因和晚期基因的表达，这些基因表达产物和Pacl消化的质粒DNA组装成病毒颗粒。

四、腺相关病毒包装

赛业生物采用第2代重组腺相关病毒包装系统制备病毒颗粒。该包装系统包含3个质粒和一株包装细胞株。

1）1个转移质粒：含有两侧有AAVITR序列的转基因表达盒子。

2）1个Rep-cap表达质粒：表达Rep和Cap两个基因。

3）1个辅助质粒：包含来自腺病毒的一些基因（E4、E2a和VA）。这些腺病毒的基因可以促进AAV基因组的复制。

4）1株含有腺病毒E1基因的293细胞。

野生型腺相关病毒基因组是一条长约4.7 kb的线性单链DNA（ssDNA）分子。基因组两末端各有一个145 nt长的Inverted Terminal Repeat (ITR)，ITR序列是对称的，自己能形成发夹结构。病毒感染细胞后，释放出单链病毒基因组，末端发夹结构促使腺相关病毒以单链基因组为模板复制互补链，形成双链DNA。野生型病毒只表达2个基因：rep (replication) 和cap (capsid)，Rep编码非结构蛋白，Cap编码结构蛋白。腺相关病毒基因组不编码polymerase，基因组DNA的复制需要用到宿主细胞表达的polymerase。将基因组上的Rep和Cap基因删除，克隆到质粒上，然后将目的基因克隆在两个ITR之间，这个质粒就成为转移质粒。而Rep和Cap基因被克隆到另外一个质粒上，成为Rep-cap表达质粒。除了Rep-cap表达质粒，还需要一个辅助质粒。这个辅助质粒表达腺病毒的一些基因（E4、E2a和VA），这些腺病毒基因可以促进AAV基因组的复制。除了3个质粒外，腺相关病毒包装系统还需要一株表达腺病毒E1基因的293细胞。

每次包装重组腺相关病毒，辅助质粒均固定不变，只要血清型不变，Rep-cap质粒也是相对固定，变化的是编码目的基因的转移质粒。因此您需重点设计转移质粒，登陆www.vectorbuilder.com即可轻松快捷地设计！

病毒包装信息由赛业（苏州）生物科技有限公司为您提供，如您想了解更多关于病毒包装报价、项目、资质、周期、参考标准等信息，欢迎来电或留言咨询。