DNase I footprinting assay服务（足迹分析）

DNase I footprinting assay（DNase I足迹分析实验）可以精确鉴定DNA结合蛋白（如转录调控蛋白）在DNA分子上的结合位点。转录调控蛋白通过与启动子区域结合来调控靶标基因的转录。目前，凝胶阻滞实验（EMSA）和DNase I足迹分析实验是重要的一套体外研究工具：凝胶阻滞实验可以确定转录因子是否与DNA直接结合，而DNase I足迹分析实验则可以精确鉴定其结合的DNA序列，从而帮助我们研究基因转录调控的机制。经典的DNase I足迹分析实验需要使用同位素进行标记，并在反应完成后通过跑原始的DNA测序胶来检测；该方法不仅危险，而且费时、对操作者的技术要求高、成功率低。针对这种情况，上海伯豪目前推出利用“荧光标记”结合ABI测序仪的方法来进行DNase I足迹分析实验。

一、“荧光标记”的优势：

1. 相对于“同位素标记”，“荧光标记”更安全、无污染；

2. “荧光标记”，实验的速度快、重复性好、灵敏度高。

• 荧光标记法，由于可以进行DNA的精确定量，并可以在常规的实验台上面操作；同位素标记法只能通过放射性强度来估测，且操作时需要特别的保护装置，操作不便。因此，荧光标记法的可重复性要远远好于同位素操作。

• 原始的PAGE测序胶对操作者的技术要求很高，且条带的清晰度受到多种实验因素的影响；ABI测序仪的操作体系非常成熟，灵敏度高，重复性好。因此，荧光标记法更灵敏度，获得的保护区域更清晰，图片的质量更好。

二、实验及数据分析流程：

三、实例分析：

原文：Characterization of a New GlnR Binding Box in the Promoter of amtB in Streptomyces coelicolor Inferred a PhoP/GlnR Competitive Binding Mechanism for Transcriptional Regulation of amtB. Journal of Bacteriology. 2012,194(19):5237-44.

四、服务说明：

• 该服务适用于：已经通过EMSA等实验证明转录调控蛋白可以结合DNA，但是需要通过DNase I足迹分析实验来进一步精确鉴定蛋白结合的DNA序列，以便研究其转录调控的机制。客户需要提供纯化的蛋白，DNA样品及引物序列，同时需要提供EMSA结果图及实验参数以便于接下来的DNase I足迹分析实验。

• 公司同时提供蛋白纯化或者EMSA实验验证，但需另计费用。

• 本服务同样适用于mRNA转录起始位点的鉴定，原理与DNase I足迹分析实验类似，即在Primer extension实验或者S1 mapping实验中用荧光标记法替代同位素标记法。客户需要提供高质量的RNA样品及目的基因序列。

五、近年来使用该技术发表的部分论文：

1. Structural and functional analysis of the transcriptional regulator Rv3066 of Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Res. 2012,40(18):9340-55.

2. LVIS553 Transcriptional Regulator Specifically Recognizes Novobiocin as an Effector Molecule. J Biol Chem. 2010,285(22):16921-30

3. Detailed analysis of the DNA recognition motifs of the Xanthomonas type III effectors AvrBs3 and AvrBs3Δrep16. Plant J. 2009,59 (6): 859–871.

4. A key developmental regulator controls the synthesis of the antibiotic erythromycin in Saccharopolyspora erythraea. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008,105(32):11346-51.

5. A Pseudomonas aeruginosa transcription factor that senses fatty acid structure. Mol Microbiol. 2007,66(3):622-32.

6. Anaplasma phagocytophilum p44 mRNA expression is differentially regulated in mammalian and tick host cells: involvement of the DNA binding protein ApxR. J Bacteriol. 2007,189 (23): 8651-9.

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