卓立汉光FLIM荧光寿命成像系统

荧光和荧光寿命

分子包含多个单能态S0、S1、S2…和三重态T1…，每个能态都包含多个精细的能级。正常情况下，大部分电子处在*低能态即基态S0 的*低能级上，当分子被光束照射，会吸收光子能量，电子被激发到更高的能态S1 或S2 上，在S2 能态上的电子只能存在很短暂的时间，便会通过内转换过程跃迁到S1 上，而S1 能态上的电子亦会在极短时间内跃迁到S1 的*低能级上，而这些电子会存在一段时间后通过震荡弛豫辐射跃迁到基态，这个过程会释放一个光子，即荧光。

此外，亦会有电子跃迁至三重态T1 上，再由T1 跃迁至基态，我们称之为磷光。

荧光特性

研究荧光特性时，主要在以下几方面进行分析：激发光谱，发射光谱、荧光强度、偏振荧光、荧光发光量子产率、荧光寿命等。其中荧光寿命（Fluorescence Lifetime）是指荧光分子在激发态上存在的平均时间（纳秒量级）。

荧光寿命测试

荧光寿命一般在几纳秒至几百纳秒之间，如今主要有两类测试方法：时域测量和频域测量时间稳定性实验测试曲线：

1 时域测量

由一束窄脉冲将荧光分子激发至较高能态S1，接着测量荧光的发射几率随时间的变化。其中目前广泛应用的是时间相关单光子计数，即TCSPC(Time Correlated Single Photon Counting)

时间相关单光子计数(TCSPC) 实现了从百ps-ns-us 的瞬态测试，此方法对数据的获取完全依赖快速探测器和高速电路。用统计的方法计算样品受激后发出的第一个( 也是*一的一个) 光子与激发光之间的时间差，也就是下图的START( 激发时刻) 与STOP( 发光时刻) 的时间差。由于对于Stop 信号的要求，所以TCSPC 一般需要高重复频率的光源作为激发源，其重复至少要在100KHz 以上，多数的光源都会达到MHz 量级；同时，在一般情况下还要对Stop 信号做数量上的控制，做到尽量满足在一个激发周期内，样品产生且只产生一个光子的有效荧光信号，避免光子对的出现。

2 频域测量

对连续激发光进行振幅调制后，分子发出的荧光强度也会受到振幅调制，两个调制信号之间存在与荧光寿命相关的相位差，因此可以测量该相位差计算荧光寿命。

左图为正弦调制激发光（绿色）频域显示，发射光信号（红色）相应的相位变化频域显示。

右图为对应不同寿命的调制和相位的频域显示。TM- 调制寿命，TP- 相位寿命。[1]

显微荧光寿命成像技术（FLIM）

显微荧光寿命成像技术（Fluorescence Lifetime ImagingMicroscopy，FLIM）是一种在显微尺度下展现荧光寿命空间分布的技术，由于其不受样品浓度影响，具有其他荧光成像技术无法代替的优异性能，目前在生物医学工程、光电半导体材料等领域是一种重要的表征测量手段。

FLIM 一般分为宽场FLIM 和激光扫描FLIM。

宽场FLIM（Wide Field FLIM,WFM）

该技术是用平行光照明并由物镜聚焦样品获得荧光信号，再由一宽场相机采集荧光成像。宽场FLIM 常用于快速获取大面积样品成像。时域或是频域寿命采集都可以应用在宽场成像FLIM 上。宽场FLIM 有更高帧率和低损伤的优势。

2 激光扫描FLIM（Laser Scanning FLIM,LSM）

激光扫描FLIM 是针对选定区域内的样品逐点获取其荧光衰减曲线，再经过拟合最终合成荧光寿命图像。相比宽场FLIM，其在空间分辨率、信噪比方面有更大的优势。扫描方式有两种：一种是固定样品，移动激光进行扫描，一种是固定激光，电动位移台带动样品移动进行扫描。

显微荧光寿命成像系统FLIM应用

材料科学领域

• 宽禁带半导体如GaN、SiC 等体系的少子寿命mapping 测量

• 量子点如CdSe@ZnS 等用作荧光寿命成像显微镜探针

• 钙钛矿电池/LED 薄膜的组分分析、缺陷检测

• 铜铟镓硒CIGS，铜锌锡硫CZTS 薄膜太阳能电池的组分、缺陷检测

• 镧系上转换纳米颗粒

• GaAs 或GaAsP 量子阱的载流子扩散研究

生命科学领域

• 细胞体自身荧光寿命分析

• 自身荧光相对荧光标记的有效区分

• 活细胞内水介质的PH 值测量

• 局部氧气浓度测量

• 具有相同频谱性质的不同荧光标记的区分

• 活细胞内钙浓度测量

• 时间分辨共振能量转移（FRET）：纳米级尺度上的远差测量，环境敏感的FRET 探针定量测量

• 代谢成像：NAD(P)H 和FAD 胞质体的荧光寿命成像

应用案例

1 用荧光分子对海拉细胞进行染色

用荧光分子转子Bodipy-C12 对海拉细胞（宫颈癌细胞的一种） 进行染色。

(a) 显微荧光寿命成像图，寿命范围1ns（蓝色）到2.5ns（红色）；

(b) 荧光寿命直方图，脂肪滴的短寿命约在1.6ns 附近，细胞中其他位置寿命较长，在1.8ns 附近。

用荧光分子转子的时间分辨测量*大的好处在于荧光寿命具备足够清晰的标签特性，且与荧光团的浓度无关。[2]

2 金属修饰荧光

金属修饰荧光：

(a) 荧光寿命是荧光团到金表面距离的函数；

(b) 用绿色荧光蛋白（GFP）标记乳腺腺癌细胞的细胞膜的共聚焦xz 横截面，垂直比例尺：5m；

(c) b 图的FLIM 图，金表面附近的GFP 荧光寿命缩短。[2]

3 钙钛矿太阳能电池

下图研究中，展示了一种动态热风（DHA）制备工艺来控制全无机PSC 的薄膜形态和稳定性，该工艺不含有常规的有害反溶剂，可以在大气环境中制备。同时，钙钛矿掺有钡（Ba2+） 碱金属离子（BaI2:CsPbI2Br）。这种DHA 方法有助于形成均匀的晶粒并控制结晶，从而形成稳定的全无机PSC。从而在环境条件下形成完整的黑色相。经过DHA处理的钙钛矿光伏器件，在0.09cm小面积下，效率为14.85%，在1x1cm的大面积下，具有13.78%的*高效率。DHA方法制备的器件在300h后仍然保持初始效率的92%。

4 MQWs 多量子阱研究

在(a) 蓝宝石和(b) GaN 上生长的MQWs 的共焦PL mapping 图像。具有较小尺寸的发光团的最高密度是观察到在GaN 上生长的MQWs。在(c) 蓝宝石和(d)GaN 上生长的MQWs 的共焦TRPL mapping 图。仅对于在GaN 上生长的MQWs，强的PL 强度区域与较长PL 衰减时间的区域很好地匹配。在(e) 蓝宝石和(f)GaN 上生长的MQWs 在A 点和B 点测量的局部PL 衰减曲线，均标记在图中。对于在GaN 上生长的MQWs，点A 和B 之间的PL 衰减时间差更高。

显微荧光寿命成像系统FLIM参数配置

北京卓立汉光仪器有限公司提供的显微荧光寿命成像系统是基于显微和时间相关单光子计数技术，配合高精度位移台得到微观样品表面各空间分布点的荧光衰减曲线，再经过用数据拟合，得到样品表面发光寿命表征的影像。是光电半导体材料、荧光标记常用荧光分子等类似荧光寿命大多分布在纳秒、几十、几百纳秒尺度的物质的选择。

参数指标：

数据处理界面

功能丰富的荧光寿命数据处理软件，充分挖掘用户数据中的宝贵信息。可自动对扫描获得的FLIM 数据，逐点进行多组分荧光寿命拟合（组分数小于等于4），对逐点拟合获得的荧光强度、荧光寿命等信息生成伪彩色图像显示。

自主开发的一套时间相关单光子计数（TCSPC）荧光寿命的拟合算法，可对荧光衰减曲线中最多包含4 个时间组分的荧光过程进行拟合，获得每个组分的荧光寿命，光子数比例，计算评价函数和残差。TCSPC 荧光寿命通常并非简单的指数衰减过程，而是与光源及探测器相关的仪器响应函数（IRF）与荧光衰减过程相互卷积的结果，因此适当的拟合方法和参数选择对获得正确可靠的荧光寿命非常重要。该软件可导入实际测量的IRF 对衰减曲线进行卷积计算和拟合。但是大多数情况下， IRF 很难正确的从实验获得，针对这种情况，软件提供了两种无需实验获取IRF 的拟合方法：

1.通过算法对数据上升沿进行拟合，获得时间响应函数IRF，然后对整条衰减曲线进行卷积计算和拟合得到荧光寿命。

2.对于衰减时间远长于仪器响应时间的，可对衰减曲线下降沿进行直接的指数拟合。该软件经过大量测试，可以很好的满足各种场合的用户需求。

MicroLED 微盘的荧光强度像（3D 显示）：

测试案例

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