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一、实验仪器:超净工作台、水平离心机、电动移液枪、200目钢筛网、5mL注射器,剪刀、镊子等器械及10cm培养皿、10mL血清移液管等耗材二、实验试剂:Hank’s液、Ficoll淋巴细胞分离液、RPMI 1640 培养基、胎牛血清、红细胞裂解液、双抗三、实验步骤:⑴颈椎脱臼处死小鼠,分离脾脏,将脾脏浸没至含1%双抗4℃预冷Hank’s液50mL离心管中;⑵在超净台上,将脾脏从离心管中取出,放置在含1%双抗Hank’s液中10cm细胞培养皿中,用剪刀去除脾脏上的附带组织;⑶用剪刀将脾脏剪碎放置200目的无菌筛网上,筛网置于10cm培养皿之上,用5mL注射器的活塞将脾脏研磨通过筛网,并用Hank’s液不断冲洗;⑷收集细胞悬液置于冰上,并用3倍悬液体积的红细胞裂解液裂解红细胞,在冰上轻轻吹打,静置10min;⑸水平离心机中,1500r/min离心10min,去上清,加Hank’s重悬细胞;⑹取2mL细胞悬液混匀,用滴管沿盛有2mL Ficoll淋巴细胞分离液的15mL离心管中将细胞悬液沿管壁轻铺于分离液面上(总体积不超过离心管2/3均可);⑺将离心管置于水平李新忠1500r/min离心10min,可以看到细胞分层;⑻用电动移液枪将移液管小心插入白色絮状(云雾层浑浊状)细胞层中吸出细胞至另一离心管中;⑼继续加入Hank’s液混匀细胞,1500r/min离心5min,去上清;⑽用含10%FBS的RPMI 1640培养基重悬即得到单个核细胞(MC)。说明:分离得到的是含有单核细胞和淋巴细胞的单个核细胞群体,如果需要针对性研究单独淋巴细胞群体,可采用淋巴细胞磁珠分选等方法对细胞再次进行分选。(下有实验附图)
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