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CCK8试剂中含有WST-8,它在1-Methoxy PMS 的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。实验一:细胞增殖分析1、制备细胞悬液:细胞计数2、接种到96孔板中:根据合适的铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样的样本可做3个重复。3、37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。4、加入10ul CCK8:由于每孔加入CCK8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基,以换液的形式加入。5、培养1-4小时:细胞种类不同,形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话,可以继续培养,以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少,需要较长的显色时间(5-6小时)。6、测定450nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。实验二:细胞毒性分析1、制备细胞悬液:细胞计数2、接种到96孔板中:根据合适的铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样的样本可做3个重复。3、37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。4、加入不同浓度的毒性物质5、37℃培养箱中培养:加入毒性物质的培养时间,要看毒性物质的性质和细胞的敏感性,一般要根据细胞周期来决定,起码要一代以上的时间。6、加入10ul CCK8:由于每孔加入CCK8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。7、培养1-4小时:细胞种类不同,形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话,可以继续培养,以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少,需要较长的显色时间(5-6小时)。8、测定450nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。
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