基因鼠繁殖流程 1 基于ES打靶技术构建的基因编辑小鼠 (1)完全性基因敲除小鼠与基因敲入小鼠 ① 去除抗性基因Neo:选择阳性TurboKnockout小鼠(F0代)与野生型小鼠杂交,获得去除打靶载体中的Neo基因的F1代杂合子KO(+/-);若是传统的ES打靶技术构建的F0代阳性基因敲除小鼠,则需先与Flp小鼠交配删除Neo基因,再与野生型小鼠交配去Flp。 ② 再从F1代中选一对杂合子KO小鼠进行自交,理论上可获得25%纯合的KO小鼠(-/-),50%的杂合KO(+/-)小鼠,25%的野生型小鼠。
基因敲入小鼠的建系流程与基因敲除小鼠的一样。
(2)条件性基因敲除小鼠 ① 与Cre小鼠杂交:TurboKnockout-floxed小鼠与组织特异性的Cre小鼠杂交,获得去除Neo抗性且单条染色体有缺失的阳性F1代组织特异性cKO杂合子小鼠(+/-);若是传统的ES打靶技术构建的,则需先与Flp小鼠交配删除Neo基因,再与野生型小鼠交配去Flp。
② 再从F1代中选一对杂合子cKO小鼠进行自交,理论上可获得25%纯合的KO小鼠(-/-),50%的杂合KO(+/-)小鼠,25%的野生型小鼠。
2 基于CRISPR/Cas9技术的基因编辑小鼠 (1)完全性基因敲除小鼠与基因敲入小鼠 ① 测序鉴定选出阳性的F0代小鼠,与野生型小鼠进行交配,PCR鉴定(片段敲除只需PCR,移码突变还需测序)选出F1代阳性杂合小鼠。 ② 选择来自同一只F0代小鼠,基因型一致的F1代小鼠,达到性成熟后互配,可获得F2代小鼠。对获得的F2代小鼠进行PCR及测序鉴定,理论上,F2代小鼠中25%为纯合子,50%为杂合子,25%为野生小鼠。
基因敲入小鼠的建系流程与基因敲除小鼠的一样。
(2)条件性基因敲除小鼠 ① 与野生型小鼠杂交:阳性CRISPR-Pro小鼠与野生型小鼠(+/+)杂交,获得F1代杂合子小鼠(+/flox)。 ② F1代杂合子小鼠(+/flox)进行自交,理论上可获得25%的纯合cKO小鼠(flox/flox),50%的杂合cKO小鼠(+/flox),25%的野生型小鼠。