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细胞流式凋亡
流式细胞技术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术,以及数据的采集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。 一、固定细胞的染色方法1)PI单染色法方法一1.收集细胞(1~5)×106个,500~1000r/min离心5min,弃去培养液。2.3ml PBS洗一次。3.离心去PBS,加入冰预冷的70%的乙醇固定,4℃,1h。4.离心弃去固定液,3ml PBS重悬5min。5.400目的筛网过滤1次,500~1000r/min离心5min,弃去PBS。6.用1ml PI染液,4℃避光30min。7.流式细胞仪检测:PI用氩离子激发荧光,激发光波波长为488nm,发射光波波长大于630nm,产生红色荧光,可分析前散射光对侧散射光的散点图及PI荧光的直方图。天津赛尔HeLa流式凋亡2)调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析1.离心收集细胞,PBS洗1~2次。2.1%多聚甲醛低温下固定15min。3.3ml PBS洗1次,70%乙醇固定,冰箱内放置1~3天。4.PBS轻洗1次5.细胞与TdT标记液37℃孵育,时间1~2h。6.PBS轻洗1次。7.细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min。8.含0.1%Triton-X 100的PBS轻洗1次。4.500~1000r/min离心5min弃去固定液,室温加入含0.2%Tween的PBS 1ml,37℃孵育15min。5.1ml PBS/FCS洗3次,每次5min。6.400目的筛网过滤1次。7.500~1000r/min离心5min去PBS/FCS,用1.0ml PI染液,4℃避光至少30min。染色在24h之内皆可行,流式细胞仪分析。二:操作注意事项1、补偿对照管很重要;2、细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞;3、细胞浓度与染色用的蛋白量要合适;4、对不同药物浓度和药物作用时间要进行摸索; 三:仪器:实验所用的流式细胞仪为COULTER EPICS XL。送检样本量:1)单个细胞:1~2×106 个细胞左右;来源于人、小鼠、大鼠或其它。2)外周血:EDTA或肝素抗凝全血,5ml左右;来源于人、小鼠、大鼠或其它。1、部分常用荧光探针,如PI等,我公司可免费提供,;特殊标记物,如CD抗体等,用户须另行购买,也可委托我公司代购;用户所提供抗体应可与样本发生特异性识别反应。2、由用户提供的样品或试剂所致的实验问题由用户负责。 附:流式细胞术检测样品推荐制备方法:细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品(PI染色)的制备:(1)待测样本制成单细胞悬液,然后200g离心5分钟,弃上清。(2)用4℃预冷的70%冷乙醇固定,4℃保存,至少固定18小时。(3)调整细胞浓度为106细胞/毫升,取1毫升细胞悬液,用PBS洗三次,细胞重悬于1毫升PI染液中,37℃孵育30分钟即可进行流式分析。(4)PI染液终浓度为50微克/毫升,RNase A终浓度为20微克/毫升。 四:流式细胞术检测凋亡注意事情:1. 附着细胞的凋亡研究:在悬液中的细胞比贴壁细胞更容易发生凋亡,建议在用胰蛋白酶处理前单独收集培养液中悬浮的细胞。2. 固定剂的影响:在做DNA断裂片段分析凋亡细胞时(如APO-BRDU、APO-DIRECT),要注意使用化学固定剂(如多聚甲醛)固定细胞,使DNA交联。原因是:在洗细胞的步骤中,未固定的细胞可能会丢失小的DNA片段,而使用化学试剂固定后的细胞,小DNA片段就不会丢失。建议做DNA断裂片段分析细胞系时,比较不同的固定剂和破膜剂的效果。3. 为了减少细胞丢失,染色、分析时建议使用12×75mm聚苯乙烯管。其它类型的试管(如聚丙烯管),会使细胞在管壁堆积,造成细胞丢失,并影响染色效果。洗细胞后,建议轻轻药匀细胞沉淀,避免使用加液枪,以免由于塑料枪头的使用造成细胞损失。4. 洗细胞时应注意应洗到管壁内侧细胞可能附着的位置,使细胞充分悬浮。这样可以避免在随后的染色步骤中,由于细胞贴壁或悬着不充分,造成细胞染色不均一。如果细胞染色不均,在荧光参数分析时,表现为双峰现象,即多出一群着色弱的细胞。5. 做APO-BRDU或APO-DIRECT分析时,若发现染色荧光若,可以适当延长BrdU掺入反应的时间。一些细胞的反应时间可以到37°C 4小时。6. 做APO-BRDU或APO-DIRECT分析时,可以结合PI染色,研究凋亡与细胞DNA周期的关系。天津赛尔生物技术相关服务:MicroRNA相关服务siRNA干扰课题整体外包服务基因克隆服务慢病毒包装服务腺病毒服务稳定细胞株筛选服务蛋白表达服务抗体制备服务DNA与蛋白相互作用研究噬菌体展示技术服务cDNA文库构建干细胞研究基金申请,标书撰写,专利申请,课题设计等 联系咨询我们地址:天津市津南区小站镇黄台工业园嘉园道8号(华若英)官网:www.saierbio.com QQ:2774964243 QQ:58214061邮箱:info@saierbio.com 电话******8001手机******吴海东
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