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一、 实验原理:无缝克隆法:基因克隆的引物设计及目的DNA片段的扩增,与常规PCR法是相同的。唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基,由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基。通过相关酶试剂处理,同时除去载体与目的DNA上同源片段的双链中的一条链,这样载体和目的DNA两端就露出了能够互补配对的序列,依靠同源序列碱基间的配对能使载体和目的DNA较为紧密的连在一起而无需酶联,直接用于转化。二、实验步骤:1、采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化;2、使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增3、将目的DNA片段和线性化载体以摩尔比2:1加到试管中进行重组反应:buffer-enzym(mix) 15 uL线性化载体 X uLPCR片段 Y uLddH2O W uLTotal 20uL4、混匀后在PCR仪中适当温度孵育30-60min,然后转移至冰上;5、克隆产物直接转化宿主菌,涂平板挑选出阳性克隆子。三、实验结果:载体构建操作步骤,引物序列信息,原始测序结果。详情请关注公司官网www.xianchunfeng.com
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