酵母单杂交/双杂交文库构建

酵母单/双杂交文库构建
   我公司总经理谢士勇毕业于华中农业大学生化与分子生物学专业，博士期间长期从事酵母单/双杂交文库构建及筛选的工作，在校期间为实验室构建了3个高效的水稻酵母双杂交文库（组织分别为水稻叶片，幼穗，种子），具有丰富的实践经验。
    公司在RNA抽提，mRNA纯化，酵母转化等步骤中对于试剂选择有着独到的见解，用性价比最高的试剂为客户节约成本。同时公司对于反转录，酵母转化，酵母菌落PCR等步骤进行优化，使得初始基因丰度更高，最大程度保证互作基因/蛋白不致遗漏；转化效率更高，提高弱互作因子筛到的可能性；均一化更高，降低重复筛到概率；空载体更少，高效并且节约成本。详情请关注公司官网www.xianchunfeng.com

本公司酵母单/双杂交文库构建核心优势：

降低客户成本：酵母单/双杂交文库构建实验步骤多，难度较大，客户自己购买试剂经济和时间成本较高。

文库质量高：优质的文库是筛库得到阳性克隆的关键，本公司承诺次级文库库容大于107，重组率大于90%，平均插入片段大于1kb。

Invitrogen核/膜系统（送三框和均一化处理）

实验原理：

酵母单杂交
真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由DNA结合结构域(DNA—binding domain，BD)和转录激活结构域(activation domain，AD)。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。在GAL4系统中构建与基因的ORFs融合的激活结构域GAL4-AD的特异载体，顺式作用元件与GAL4的DNA结合结构域GAL4-BD融合构建载体，分别转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若与顺式作用元件发生相互作用时，就会将GAL4-BD和GAL4-AD结合在一起，从而与上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)结合，激活相应报告基因的表达，在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。基因转录实际上是转录调控因子和启动子区各种顺式作用元件相互作用的结果，这种结合犹如蛋白质与蛋白质的互作一样具有特异性，这是研究顺式作用元件即DNA序列与蛋白质互作的基础。


酵母双杂交
酵母双杂交系统是在酵母体内通过重建有活性转录因子的结构来鉴定蛋白质之间的相互作用。转录因子可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录。这种DNA结合与转录激活的功能是由转录因子上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(Binding Domain, BD)和转录激活结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录激活都是必须的。在GAL4系统中利用转录因子GAL4的DNA结合结构域GAL4-BD与激活结构域GAL4-AD的特异载体，分别与基因的ORFs融合，转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若发生相互作用时，就会将GAL4-BD和GAL4-AD结合在一起，从而与上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)结合，激活相应报告基因的表达，在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。酵母双杂交文库的构建是筛库的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大规模筛选分析蛋白质间的相互作用，是现在分子生物学与生物化学常用的手段。

二、实验步骤：
1.1   RNA提取

1.2   mRNA分离

1.3   cDNA初级文库的构建
1.3.1 cDNA第一链的合成
1.3.2 cDNA第二链的合成
1.3.3 cDNA adapter的制备
1.3.4 cDNA与attB1重组接头连接(三份接头各连一份)
1.3.5 cDNA分级分离
1.3.6 BP重组
1.3.7 电转化大肠杆菌DH10B
1.3.8 文库克隆检测
1.3.9 文库库容量、重组率、插入片段长度鉴定

1.4   cDNA次级文库的构建
1.4.1 初级文库的质粒抽提
1.4.2 LR重组
1.4.3 电转化大肠杆菌DH10B
1.4.4 文库克隆检测
1.4.5 文库库容量、重组率、插入片段长度鉴定

三、交付结果：
1. 文库构建报告（电子版），
2. 文库构建图片（电子版），
3. 大肠杆菌甘油菌文库2支，质粒文库1支。

四、服务周期：
30个工作日

五、材料条件：
客户提供组织或细胞

六、客户案例
目前我们已经成功为陕西师范大学，西北大学，西北农林科技大学，唐都医院，西京医院，第四军医大学，贵州师范大学，华中农业大学等多家单位完成酵母单/双杂交文库构建服务，专业的服务和严谨的态度赢得了客户的一直好评。

七、部分结果图片

详情请关注公司官网www.xianchunfeng.com

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