siRNA质粒载体/microRNA/过表达载体/稳转细胞株(英拜生物)

                       英拜生物 siRNA载体构建服务程序：

1. siRNA表达载体的选用：
本公司选用的siRNA表达载体含新霉素抗性基因和GFP绿色萤光标记，可以建立稳定表达系，同时可以实时监测载体在细胞中的转染效率。载体中还含有Amp 抗性基因，可以无限扩增。

2. 设计siRNA 靶序列
A、根据目的mRNA序列，设计3 条RNA干扰靶序列，靶序列一般为19－21nt长。
B、对于每条选定的siRNA靶序列，设计siRNA正义链和反义链，以loop(9nt)相连，称为shRNA（short hairpin RNA）。

3. 合成模板：
合成每条编码shRNA的DNA 模板的两条单链，退火DNA 单链得到shRNA的DNA双链模板。模板链后面接有RNA PolyIII聚合酶转录中止位点， 同时两端分别设计BamHI和HindIII酶切位点， 可以克隆到siRNA载体多克隆位点的BamHI 和 HindIII酶切位点之间。

4. siRNA空载体用BamHI 和 HindIII双酶切后，1％琼脂糖凝胶电泳，回收线性载体。

5. 连接与转化：
把退火的DNA 模板双链连接到线性载体中。采用T4连接酶，插入片断与载体的摩尔比约为3：1。连接产物转化DH5α 大肠杆菌，在LB Amp培养基上涂板，37℃培养过夜。

6. PCR鉴定：
挑取转化的菌落PCR，2％琼脂糖凝胶电泳鉴定具有shRNA编码序列的阳性克隆（图例）。

7.测序鉴定：
对PCR鉴定阳性的克隆再进行测序鉴定，确定shRNA编码框架和模板序列正确无误(图例)。

8. 柱抽提阳性克隆载体并定量。

siRNA 序列的siRNA™试剂盒包括：
√ 3条编码shRNA的载体（各10µg）,保证其中一条siRNA 序列的有效.
√ 1条编码阴性对照shRNA的载体（10µg）
采用的阴性对照是通用序列，在人和小鼠的基因组中都没有同源位点；
√ 大肠杆菌DH5α菌株
√ siRNA载体的构建、鉴定记录及使用说明。

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