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筛选稳定细胞株的两种方法 1、转染质粒后,单克隆方法筛选稳定细胞系 对大多数细胞转染效率较低。对于基因过表达,如果转染效率达到40%,基因过表达尚可。但是对于基因干扰实验,对转染效率要求远远高于基因过表达,通常质粒转染无法满足。另外,质粒游离于细胞质中,很快降解,无法满足较长时间的检测项目;质粒转染整合几率极低,稳定细胞株构建耗时耗力,且得率很低,往往需要挑取单克隆株。 2、病毒感染筛选稳定细胞株 病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效,是目前主流的稳定细胞系筛选方法。用慢病毒制备稳转细胞株,由于其高效整合、高效转录、高效表达、宿主范围广,感染效率高,且与细胞染色体整合而不发生基因重排,是制备稳定细胞株的理想载体。 稳定转染细胞株服务流程 1、载体构建:将外源基因构建到合适的载体上,如需病毒转染,则包装病毒。 2、筛选浓度测定:以 10-14 天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度。 3、细胞接种:转染实验前天接种细胞,各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞应达到 60%-80% 覆盖。 4、细胞转染:用构建好的载体(或包装好的病毒)转染目的细胞。 5、抗生素筛选。6、鉴定筛选结果。 客户需要提供 1、构建好的外源基因载体或基因模板。 2、待转染的细胞系( 1×106 个细胞,可传代,倍增时间小于 48 小时),特殊细胞需提供培养基。 我们提供 1、构建好的外源基因载体。2、构建好的稳定细胞系。 3、构建稳转细胞株实验报告及相关的外源基因表达分析。
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