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细胞转染及筛选稳定细胞系定义:细胞转染是指将外源分子如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。分类:常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染两类。瞬时转染的外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元 件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白等来帮助检测。稳定转染的外源DNA可以整合到宿主染色体中。通常需要通过一些选择性标记,如新霉素抗性基因(APH;neo),潮霉素抗性基因(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选, 得到稳定转染的同源细胞系。筛选稳定细胞系的实验流程:1. 筛选浓度测定:以10~14天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度;2. 细胞接种:转染实验前天接种细胞,各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80%覆盖;3. 细胞转染(脂质体);4. 利用质粒上含有的抗性选择进行筛选;5. 鉴定筛选结果。 相关要求(客户提供):1.生长状况良好的细胞株,细胞特性,培养条件及相关注意事项;公司可负责代购;2.转染级别质粒,包括质粒大小,浓度,抗性等相关背景资料; 交付结果:1. 具体实验报告(包括实验步骤和主要仪器及试剂说明);2. 目的质粒转染前后细胞培养图片和荧光图片;3. 稳定筛选的细胞株,培养条件和培养图片;4. 实验中没有用完的由客户提供的质粒等。
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