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单细胞基因组测序是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增,获得高覆盖率的完整的基因组之后进行高通量测序,用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。全基因组测序的应用范围涉及临床医药研究、群体遗传学研究、关联分析、进化分析等众多领域。1、实验方案 测序策略:Illumina 平台 PE150 数据量:推荐30~50×测序深度2、技术优势(1) 多种变异检测:单核苷酸多态性(SNP)、插入缺失(InDel)和结构变异(SV);(2) 与芯片方法比较,可以检测到新的变异序列;(3)与人类全基因组从头测序相比,耗时更短、成本更低。3、数据分析3.1 标准信息分析(1)按标准流程进行数据整理及数据质量评估;(2)与参考基因组比对;(3)SNP的检测及其在基因组的分布;(4)InDel的检测及其在基因组的分布;(5)CNV的检测及其在基因组的分布;(6)包含变异基因的功能注释(GO注释、Pathway注释)。 3.2 高级信息分析(肿瘤基因组学)(1)癌基因/抑癌基因/易感基因筛查;(2)高频突变基因统计及通路富集分析;(3)NMF突变特征及突变频率分析;(4)NovoDriver已知驱动基因筛选;(5)基因组变异Circos图展示。4、技术流程
5、案例分析 案例(1) 单细胞基因组测序解构正常成人大脑的单个神经元突变 来自霍华德休斯医学研究所的(HHMI)的研究人员从三位去世的成人捐赠的健康大脑中分离出了36个神经元并测序了它们的基因组。为了进行比较,科学家们还从每个个体的心脏中分离出了细胞进行DNA测序。他们发现每个神经元的基因组都是独特的。每个神经元都有1000多个点突变,只有少数突变出现在一个以上的细胞中。尽管神经元中的大多数突变是独特的,一小部分出现在了多个细胞中。这表明了这些突变起源于脑细胞仍在分裂之时——这一过程在出生前便完成。这些早期突变随细胞分裂和迁移传递下去,科学家们能够利用它们来重建部分大脑发育史。
图1 脑中体细胞SNV位点与神经系统功能和疾病相关
案例(2) 一种新的单细胞基因组测序方法-组合索引测序 单细胞基因组测序对检测体细胞突变是很有效的手段,特别是在肿瘤进化的背景下。因当前建库成本较高,限制了可被评估的细胞数目,从而限制了组织异质性的检测。该研究开发了单细胞组合索引测序(SCI-seq),该方法可同时产生数千个低通的单细胞文库以检测体细胞拷贝数变异。研究人员从培养的细胞系、灵长类动物前额皮质组织和两个人腺癌样本中构建了16698个单细胞文库,并详细评估了胰腺肿瘤的亚克隆变异。
图1 恒河猴脑中的体细胞CNV
参考文献[1] Lodato et al. Somatic mutation in single human neurons tracks developmental and transcriptional history. Science, 2015.[2] Vitak et al. Sequencing thousands of single-cell genomes with combinatorial indexing. NatureMethods, 2017.
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