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TUNNEL检测细胞凋亡细胞在发生凋亡时,会激活一些DNA内切酶,这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测,可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时,暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ,从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测,这就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法检测细胞凋亡的原理。TUNNEL检测细胞凋亡实验步骤
按照实验订单内容进行细胞爬片或准备好冰冻切片,加4%多*甲醛进行固定,室温固定20-30min。
PBS洗涤3次,每次5min。
通透:1%Triton X-100 处理样本,室温下通透3-5min。
配制TdT酶反应液:计算好样本量,每个样本用量为:在45μl Equilibration Buffer 加入1.0μl biotin-11-dUTP和4.0μl TdT Enzyme,即配即用,注意避光。
样本周围用吸水纸吸干,每个样本上滴加50μl TdT酶反应液,放入避光的湿盒中,37℃避光反应60min。
Streptavidin-TRITC试剂按每个样本5μl用量和45μl Labeling Buffer 混匀,计算所需总量。即用即配,注意避光。
样本周围用吸水纸吸干,每个样本上滴加50μl Streptavidin-TRITC 标记液,放入湿盒,37℃避光反应30min.
DAPI(Hoechst)染色液复染细胞核,室温避光反应15min。
荧光显微镜下观察,激发波长543nm,发射波长571nm。
结果展示:实验完成周期及交付标准:1.实验周期: 详谈2.交付标准:1、TUNNEL检测细胞凋亡原始图片;200或400× 3张;2、详细实验报告,包含所需试剂耗材、仪器设备、操作过程。需确认的信息(客户提供):1.提供检测样本(细胞,切片或固定液固定的组织,或者我们代培养及处理细胞,则需收取相应的细胞扩培及处理费用大约需要5*10^5/样)
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