上海伯豪外显子组测序应用案例解析

应用案例一：HBV相关的肝细胞癌外显子组研究

肝癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是一种严重威胁人们健康的恶性肿瘤，每年约有70万患者死于肝癌。在中国，肝癌每年发病人数超过25万人，其发病主要与乙肝病毒感染、酒精肝、食物受黄曲霉毒素污染等原因有关。肝癌的高致死率主要是由于其具有很强的侵润和转移能力，特别是常常侵入肝内血管，形成肝内转移，病理学特征是门静脉癌栓（portal vein tumor thrombosis, PVTTs）。目前导致肝癌转移的分子机制以及决定肿瘤细胞转移的变异基因尚不十分清楚。因此，寻找导致肝癌转移的关键基因，可以为临床肝癌转移诊断、监测及靶向治疗奠定坚实的理论基础。

为了识别和鉴定肝癌转移相关的关键突变基因，在国家科技部973计划和卫生部“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项等支持下，国家人类基因组南方研究中心韩泽广教授领衔，生物芯片上海国家工程研究中心黄健研究员、国家人类基因组南方研究中心邓庆博士、上海伯豪生物技术有限公司肖华胜博士等，联合国内多家临床医院共同攻关，开展了这项研究工作，取得了重要突破。 相关成果发表在2012年8月26日的Nature Genetics上。其中全外显子组测序与部份数据分析等工作主要由上海伯豪生物技术有限公司完成。

研究人员首先收集了10例HBV阳性肝癌患者的癌旁、癌和肝内转移的门静脉癌栓共29个组织样本。利用上海伯豪生物技术有限公司的Illumina GAIIx和ABI的SOLiD高通量测序平台，进行全外显子组测序分析。比较分析原位癌和转移灶的测序结果，发现肿瘤细胞存在347个突变基因，平均每个肿瘤样本有30-40个基因突变，其中大多数基因突变是第一次在肝癌样本中发现，并且在原发灶和转移灶中同时出现。说明肝癌的发病和转移与基因突变密切相关，并且转移相关基因在原发癌中就已经发生了突变。具体分析基因突变的类型，发现有5位患者存在明显的C:G>A:T突变，有4位患者存在明显的T:A>A:T突变。

部分在原发癌和转移灶中都存在的突变基因的分布。

基因突变的分布。大多数基因突变同时存在于原发癌和转移灶中。

信号通路分析发现这些突变基因主要与细胞粘着、运动、迁移和形态形成有关。其中有10个基因存在2个以上的非沉默突变，包括TP53，ARID2，ARID1A等。为了确定哪个突变基因在肝癌转移中发挥关键作用，研究人员进一步在大量肝癌样本中对这10个突变基因进行评估。结果发现，在110份HBV阳性肝癌中有14例（约占13%）ARID1A基因发生了突变。此外，研究人员采用RNA干扰技术评估了91个已证实存在突变的基因对肝癌细胞生长的影响。结果表明其中有7个基因，包括VCAM1和CDK14可能与肝癌细胞生长和浸润能力密切相关。ARID1A基因负责编码SWI/SNF染色质重塑复合物的一个元件。VCAM1除了突变外，还在多数肝癌样本中表达下降。而与细胞增殖相关CDK14基因突变则会增强该基因功能，导致细胞生长加快，促进转移，可能是肝癌治疗新靶标。

这一研究为我们提供了可能与中晚期肝癌相关的体细胞突变的图谱，并为人们发现了解肝癌发生、转移机制提供了重要线索。

原文：Jian Huang, Qing Deng,Qun Wang,Kun-Yu Li,Ji-Hong Dai,Niu Li,Zhi-Dong Zhu,Bo Zhou,Xiao-Yan Liu,Rui-Fang Liu,Qian-Lan Fei,Hui Chen,Bing Cai,Boping Zhou,Hua-Sheng Xiao,Lun-Xiu Qin,Ze-Guang Han. Exome sequencing of hepatitis B virus–associated hepatocellular carcinoma. Nature Genetics(2012).doi:10.1038/ng.2391

应用案例二：利用序列捕获结合测序技术研究研究人全外显子结构变异/突变（肺癌细胞系）

研究策略：SBC利用NimbleGen Sequence Capture 2.1M Human Exome Array + Illumina GAIIx测序研究17个肿瘤细胞系

结果展示：下图显示了SBC对若干不同肺癌病人的全外显子组捕获后深度测序的实验结果。可以看到：在不同病人样本的某基因外显子区存在不同的SNV。

人全外显子捕获生物信息分析

应用案例三：利用序列捕获结合测序技术研究Schinzel-Giedion综合症

Alexander Hoischen, Bregje W M van Bon, Christian Gilissen et al.. De novo mutations of SETBP1 cause Schinzel-Giedion syndrome, NATURE GENETICS, 2010, doi:10.1038/ng.581.

技术策略：利用Agilent Sureselect Human Exome kit（38Mb）结合SOLiD测序技术（1/4 slide）分别对无血缘关系的4名Schinzel-Giedion综合症患者的外显子组序列进行了测序。

结果展示：发现这4个样本在SETBP1位点均存在杂合新生突变（heterozyous de novo mutation），用Sanger法对另外8个患儿的SETBP1位点进行测序验证，亦发现该位点同时出现了突变，而所有的点突变集中于高度保守的11nt的外显子区域。

已知及预测的SETBP1蛋白质结构域及12个Schinzel-Giedion综合症患者突变位点（星号表示）示意图

应用案例四：利用序列捕获结合测序技术寻找与癌症发病相关的SNP

技术策略：SBC利用Agilent SureSelect Enrichment System + ABI SOLiD3分别对正常人、癌症患者不同细胞系进行目标CDS区捕获和测序，以寻找与癌症发病相关的SNP。

结果展示：探针覆盖度2×（Agilent SureSelect e-Array Bait设计），靶基因总数2676，目标CDS区总数11,824，目标CDS区全长2,414,977bp。得到以下结果：

参考文献
1． Alexander Hoischen, Bregje W M van Bon, Christian Gilissen et al.. De novomutations of SETBP1 cause Schinzel-Giedion syndrome, NATURE GENETICS, 2010, doi:10.1038/ng.581.
2． Sarah B. Ng, Emily H. Turner, Peggy D. Robertson et al..Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature, 2009, doi:10.1038/nature08250.
3． Andreas Gnirke, Alexandre Melnikov, Jared Maguire et al..Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nature Biotechnology, 2009,doi:10.1038/nbt.1523.

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