转录组测序(RNA-Seq)(碧云天)

转录组测序RNA-Seq是基于二代测序技术的转录组学研究方法：首先提取生物样品的全部转录的RNA并进行mRNA富集，然后反转录为 cDNA后进行的高通量测序，在此基础上进行片段的拼接组装，从而可得到一个个的转录本，进而可以形成对该生物样品当前发育状态的基因表达状况的全局了解。不同阶段或部位的生物样品的RNA-Seq转录组进行比较分析，则可以在转录层面得到基因表达水平的变化，针对关键基因则可以进行代谢通路(Pathway)的构建。

碧云天高通量测序与数据分析技术服务项目表：

备注：质检首次免费，如果样品首次质检不通过，后续再进行质检每样加收100元。核酸抽提与质检、自制文库质检以及数据分析报价如下。

碧云天高通量测序样品制备与质检技术服务项目表：

注：以上样品制备与质检技术服务项目仅作为高通量测序的配套服务，不单独提供相应服务。

碧云天高通量测序技术服务询价与订购：

1. 请您下载并填写《 碧云天高通量测序服务询价表》，发送至ngs@beyotime.com，我们将为您设计最佳方案。

2. 若有订购意向，碧云天的高通量测序技术服务人员会与您联系，并签订《碧云天高通量测序技术服务协议书》。

3. 送样时，请下载并填写《碧云天高通量测序生物样品信息表》，发送至ngs@beyotime.com或碧云天高通量测序技术服务人员邮箱。样品的具体要求参见《碧云天高通量测序生物送样要求》。

碧云天高通量测序技术服务优势：

1. 技术经验丰富：碧云天拥有强大的技术团队，具有多年的核酸纯化试剂盒开发经验，在核酸样品处理方面有丰富的操作经验。

2. 分析能力强：碧云天有专业的生物信息分析团队，为您提供完善的分析服务。

3. 服务全面快速：碧云天有多年的试剂研发经验，有完备的分子生物学产品线和完善的生物技术服务体系，可为您后继实验提供跟踪服务。另外，我们承诺以最快的速度去解决您遇到的问题。

4. 实验平台灵活：碧云天现在主要利用主流的Illumina平台为主，可以根据实验目的和要求灵活运用不同的实验平台的优势。

5. 性价比高：碧云天以最优惠的价格为您提供最全面的服务，帮助您有效节约实验成本。

碧云天高通量测序技术服务客户须知：

1. 样品寄出前，请给ngs@beyotime.com或碧云天高通量测序技术服务人员邮箱发送一份填写完整的电子版《碧云天高通量测序生物样品信息表》；如有特殊情况，请在快递发出前与碧云天高通量测序技术服务人员电话联系，比如客户自送样品、提前寄送样品、有其它物品随样品一起快递需要额外点收等，以便安排人手，防止丢失。

2. 请将填写完整的纸质版《碧云天高通量测序生物样品信息表》以及其它技术资料(如有)密封于塑料袋内，随样品一起寄出；协议书和硬盘(数据量较大，需硬盘存储)请另单快递给对应接收人员，不要与样品一起快递，既避免物流分拣环节导致合同和硬盘遗失，也避免干冰或蓝冰冷凝水可能损坏文件和硬盘。

3. 如果需要进行生物信息学分析，请在《碧云天高通量测序生物样品信息表》的“项目描述”栏目里注明。

4. 样品置于1.5ml或其它型号的低吸附离心管里；管上清楚标明样品名称，样品管上的名称要与《碧云天高通量测序生物样品信息表》一致，请双人核实无误；用parafilm膜把样品管缠紧密封好；将样品管置于保护用的50ml离心管或其它容器里，用适量纸、纱布或棉花塞紧，防止样品管晃荡，旋紧盖子。

5. 根据样品类型选择室温、蓝冰或者干冰包装，选择最快的运输方式以免样品降解；合理安排发货时间，避免周六、周日或法定节假日到达，以免样品丢失。低温运输采用安全的干冰，不要用危险的液氮；液氮如果渗进样品管，在温度发生变化时因体积膨胀有可能导致爆炸，毁坏样品。

6. 项目结束后，剩余样品免费保存6个月；如果需要延长保存期或者返还，请提前与碧云天高通量测序技术服务人员联系。

7. 其它详细的样品要求请见《碧云天高通量测序生物送样要求》。

碧云天转录组测序技术服务项目明细：

转录组测序(RNA-Seq):对表达的mRNA进行测序，可获取机体在一定条件下的基因表达情况以及基因在表达层面变异情况，从而研究相关基因的作用机制。

技术流程

技术参数

测序平台与方式：HiSeq, PE150
测序数据量：建议不低于6 Gb/样品(约40M Reads)
测序及基础分析周期：20个工作日

样品要求

1. 样品类型：total RNA，溶解于DEPC-水或者RNase-free的缓冲液中。

2. 样品总量：每个样品不少于2μg。

3. 样品浓度：≥100 ng/μL。

4. 样品纯度：OD_260/280≥2.0；完整性RIN≥8.0。

5. 样品运输：样品置于1.5ml管中，封口膜封好，干冰运输。

数据分析内容
基础分析

1. Reads QC/QA

2. 比对到参考基因组

3. 转录本组装

4. 基因表达水平分析

5. 基因差异表达分析和差异表达基因筛选

6. 差异表达基因的功能富集分析(GO, KEGG等注释分析)

7. 差异表达基因PPI分析

8. SNP/InDel 分析

9. 可变剪切分析

高级分析

1. 特定功能的基因的差异表达情况

2. 基因共表达分析

3. 新转录本预测

4. 融合基因分析

应用案例

低龄急性成淋巴细胞性白血病病例中发现新的DUX4融合基因
Yasuda, T., et al., Recurrent DUX4 fusions in B cell acute lymphoblastic leukemia of adolescents and young adults. Nature genetics, 2016.

研究人员利用HiSeq对73名患有B细胞急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、T细胞ALL以及来源不明ALL年轻人的AYA-ALL(15~39岁)样品(所有患者属于白血病亚型，该亚型病例的特征是缺失BCR-ABL1融合或者费城染色体)进行了RNA测序分析，发现了十几个新的候选融合基因。将RNA测序和RT-PCR相结合，该团队研究了额外61例BCR-ABL1融合阴性的B细胞ALL患者样品三种最常见新融合的发生率，包括DUX4，ZNF384或MEF2D。最常见的融合是DUX4基因的重复序列插入免疫球蛋白IGH位点，该融合在10个样品中存在。虽然DUX4融合仅在青年人患者中出现，但ZNF384融合在该年龄段内更常见，而MEF2D融合在儿童患者人群和15~39岁B细胞ALL患者人群中都有检测到。后续的细胞系和小鼠模型实验结果表明，DUX4-IGH融合可能会促进B细胞谱系向B细胞白血病的发展。

AYA-ALL中的融合基因

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