阅微基因 16S/18S/ITS扩增子测序

仪器描述

16S/18S/ITS扩增子测序

细菌的16S rDNA，真核微生物的ITS或18S rDNA序列既有结构与功能上的高度保守性，又有种属间高变性的特征，对其扩增后进行测序就被称为扩增子测序。扩增子测序是研究环境微生物群落结构组成、挖掘样品间微生物差异、研究其多样性的重要方法。

简介

16S/18S rDNA分别是编码原核/真核细胞核糖体小亚基的DNA序列，而真菌18S、5.8S和28S rDNA基因间隔序列称为ITS。这些序列中的保守区反映了生物物种间的亲缘关系，而高变区具有属或种的特异性，成为微生物系统发育和分类鉴定的推荐指标。

环境微生物多样性检测是指通过对环境中微生物的16S rDNA 、18S rDNA或ITS高变区的PCR扩增产物进行高通量测序并分析该环境下微生物群落的多样性及特征，因此微生物扩增子测序又被称为微生物多样性测序。

应用领域

· 医学领域：疾病与人体肠道、表皮微生物的关系；
· 动物领域：肠道、瘤胃（如产甲烷菌类群）与动物健康/营养消化研究等；
· 农业领域：根际微生物与植物互作、农作/农药/施肥与土壤微生物群落等；
· 环境领域：雾霾处理、污水治理、石油降解、酸性矿水处理及海洋环境等；
· 特殊极端环境：深海、高原、荒漠等极端环境下的微生物类群、资源研究。

技术路线

技术优势

测序策略

收样要求

您可以得到的数据分析

案例解析

肠道微生物影响抗PD-1免疫疗法治疗黑色素瘤的疗效

免疫检查点阻断药物会激活人体自身的免疫系统来攻击癌细胞，从而让大约25%的转移性黑色素瘤患者受益，但是这些免疫治疗反应并不总是持久的。美国德州大学安德森癌症中心（M. D. Anderson）的Jennifer Wargo博士团队欲探索人体肠道微生物是否影响癌症患者对免疫疗法的反应，他们收集了112名接受抗PD-1免疫疗法的黑色素瘤晚期患者治疗前的口腔组织与粪便样本，同时也收集了健康人群的样本，利用16S rDNA和宏基因组测序手段分析样本中微生物组成多样性和潜在功能。结果显示：癌症病人口腔样本中的优势菌群为乳杆菌目细菌 (Lactobacillales)，而粪便样本中则为拟杆菌目细菌 (Bacteroidales) 。在进行抗PD-1治疗6个月后，患者可以分为对治疗响应组(R, n=30)和不响应组(NR, n=13)。结果显示响应组的肠道菌群α多样性显著高于不响应组。肠道中含有大量梭菌目细菌 (Clostridiales/Ruminococcaceae) 的患者更有可能响应抗PD-1免疫治疗，而拟杆菌目细菌 (Bacteroidales)占有优势的患者响应治疗的机率较低。

进一步分析宏基因组测序数据，治疗响应组患者样本中微生物的基因功能富集在代谢合成途径，包括氨基酸生物合成等，而不响应组则富集在代谢分解途径。为了证明其肠道微生物和免疫治疗响应的因果关系，研究人员通过粪菌移植（fecal microbiome transplant, FMT）方法将来自于响应组和不响应组患者的粪便微生物移植到无菌小鼠中。结果显示，接受响应组患者粪菌移植的小鼠，其肿瘤生长率显著下降，有更高水平的有益T细胞和更低水平的免疫抑制性细胞。这些小鼠在接受免疫检查点阻断治疗时也表现出更好的治疗结果。本研究为抗PD-1免疫治疗获益人群的筛选工作提出了新的思路。

V. Gopalakrishnan et al., "Gut microbiome modulates response to anti–PD-1 immunotherapy in melanoma patients"Science(2017) DOI:10.1126/science.aan4236 （Impactr factor: 37.2）

A. 图为口腔试子（n=109），下为粪便(n=53) 的菌群分布柱状图，不同颜色代表不同的细菌类别（丰度>0.1%）。

B. 进化分支图（taxonomic cladogram, LEfSe图），图中圆圈从内到外依次代表不同的分类级别，点的大小和物种的丰度成正比，蓝色为治疗响应组，红色为不响应组。

细菌多样性可作为生物指标显示生物炭在污水污泥堆肥高温期的修复作用

污水污泥在日常生活和工业生产中的产生是不可避免的，因此如何可持续的处理污水污泥一直是科学家们关注的热点。污水污泥的堆肥过程属于自发热生物过程，在多种微生物作用下会将其转化成具有价值的肥料或材料。在转化过程中，污水污泥的成分、湿度和重量等都会影响微生物群落的组成，从而间接影响堆肥的效率与结果。在堆肥过程中加入生物炭可以减少肥料营养和生物气体的丢失，具有很多好处。本研究利用16S rDNA扩增子测序对不同生物炭添加量对堆肥过程中微生物丰度和多样性的影响进行探讨，同时探索在堆肥高温阶段的生物标志物。

本文中对污水污泥堆肥时7组不同生物炭含量（0-17%）进行研究，在所有样本中，有35个优势菌种，其中Proteobacteria，Firmicutes和Chloroflexl在每个处理组中都是丰度最高的。通过β多样性分析，得出不同的生物炭加入量会显著影响菌种的丰富度和多样性。最后，资料显示Pacteroidales，Paracoccus，Agrobacterium和Devosia可以被用来当做堆肥的高温阶段的生物标志物。

M.K. Awasthi et al., "New insight with the effects of biochar amendment on bacterial diversity as indicators of biomarkers support the thermophilic phase during sewage sludge composting"Bioresource Technology(2017) DOI: 10.1016/j.biortech.2017.04.100（Impact factor: 5.65）

A. 花瓣图：T1-T7代表不同生物炭添加量实验组别，中间为7个样本共有的OTUs。

B. Krona物种注释结果：圆圈从内到外依次代表不同的分类级别，扇形的大小代表不同OTU注释结果的相对比例。

研究趋势与研究热点

扩增子测序，由于成本低、周期短、对样品质量要求低等特点，已经广泛的被运用到了各类环境体系的微生物研究中。研究热点主要包括了以下几个方面：

1.人体或动物微生态，如肠道菌群，皮肤菌群的结构和多样性的探究
2.自然环境微生态，如作物根系或受污染等土壤微生物，海洋、污水、污泥等水体微生物菌落结构和多样性探究
3.工业环境微生态，如食品发酵液，工业废水、污泥处理器中微生物的多样性，以及产甲烷菌、硝化/反硝化细菌的功能基因研究
4.除上述环境外的特定环境中微生物分布及多样性调查
5.环境核心微生物/特定关注微生物在不同处理间的差异展示
6.在食品或药品的微生物安全检测中也有所应用

客户常见问题

实验设计时不同类型研究以多少生物学重复为宜？

为了数据质量、结果产出及顺利投稿，必须注意生物学重复问题。考虑到个体差异、后期组间统计学分析以及偏离样本等因素，自然环境样品要求至少3个生物学重复，推荐5个；若是人类的肠道、粪便等样品，由于个体特异性高，建议10个以上的生物学重复。

16S测的是哪一个区域？

16S rDNA（16S rRNA gene）是细菌分类学研究中最常用的“分子钟”，其序列包含9个可变区（variable region）和10个保守区（constant region）。保守区在菌种间差异不大，可变区因菌种而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。通过检测16S rDNA的序列变异和丰度，可以了解环境样品中微生物群落多样性信息。基于16S rDNA的分析在微生物分类鉴定，微生态研究等方面起到重要作用。一般常测V3+V4（PE250、PE300）或V3、V4区（PE150）,也可搭配三代测序进行全长分析。

PCA、PCoA、NMDS的生物学意义及区别？

PCA、PCoA、NMDS图都是反映样本间的差异和距离的，PCA是运用方差分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，坐标轴为能够最大程度反映方差的两个特征值（主成分），如果样本组成越相近，反映在图中的距离越近。PCoA是通过一系列的特征值和特征向量进行排序，选择排在前几位的特征值，以此来描述和观察个体或群体间的差异。NMDS图是基于进化关系或数量距离矩阵，来描述样本间差异。这三种图都是用于比较样本或样本组间的差异。通过样本点的距离，体现样本间的差异程度。距离越大，差异越大。