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Nature Methods 关注技术|新一代蛋白组技术+WB替代技术重磅来袭
随着质谱仪器的不断更新换代,蛋白组学的技术也不断的革新,从最早的2-D电泳技术到基于LC-MS/MS的蛋白定性;从Label free 技术到标记定量iTRAQ/TMT技术以及时下备受推崇的DIA/SWATH技术、PRM/MRM技术,每一次的技术革新都使得蛋白组学研究更上一阶。蛋白DIA定量分析技术也被《Nature Methods》杂志评为最值得关注的技术之一。
DIA+PRM技术
当下蛋白组学研究中应用最广泛的技术是同位素标记定量(iTRAQ/TMT技术)。iTRAQ/TMT技术是利用DDA扫描模式,其扫描的方式是将一级质谱信号最强的Top 20的多肽进行二级打碎,然后进入二级质谱进行检测。其优势是二级谱图采集的肽段信息都来源于同一条多肽,有利于后续的定性分析,但这种采集方式会忽略一些肽段的信息;而且对于大样本量的组学实验,iTRAQ/TMT技术也存在一定的通量限制。那么有没有一种技术可以解决目前蛋白组学困局呢?
对于组学数据的验证,常规的方法有:PCR、RT-PCR、WB技术、ELISA技术等,但是对于蛋白组学的验证,RNA水平的验证显然不能满足科研工作者的要求;WB技术和ELISA技术虽然在某种程度上解决了不同组学之间的尴尬,但是由于抗体的定制难度,在非模式物种中的应用一直无法进行。在这样的一个基础上,DIA、PRM技术隆重登场...DIA+PRM技术可以解决目前蛋白组学中存在的这些问题。
DIA技术是先利用常规DDA质谱检测技术分析建立图谱库,之后采用DIA方法进行质谱数据采集,从而实现对样品中蛋白质的定性及定量,不同于传统的DDA技术,DIA技术将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口,高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测,因此可以无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息,数据利用度大大提高,缺失值更少。因此,DIA技术更适合于大样本量、复杂体系的蛋白检测。
DIA技术流程
DIA技术是基于质谱的新一代蛋白组学技术,DIA技术采用数据非依赖性采集扫描模式,摆脱了传统DDA(代表性技术:iTRAQ/TMT)扫描的偏好性制约,可以无遗漏地获得样本中所有离子的碎片信息,以达到样本数据的完整性。
DIA技术较传统的iTRAQ/TMT/Labelfree蛋白组技术而言,具有如下优势:
1. 保证了数据的完整性,缺失值少。
2. 克服了iTRAQ/TMT的通量低的限制。
3. 提高了低丰度蛋白的检出率。
4. 鹿明生物基于Thermo公司的QE-HF高端质谱,检出率提升20%以上。
PRM:平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring) 是一种基于高分辨、高精度质谱的离子监视技术,能够对目标蛋白质、目标肽段(如发生翻译后修饰的肽段)进行选择性检测,从而实现对目标蛋白质/肽段进行相对或绝对定量。PRM技术是基于质谱的靶向验证蛋白组学技术,完美的替代了基于抗体的Western blot、ELISA等。PRM技术运用平行反应监测技术特异性地选择与预先设定质荷比相同的肽段离子并进行定量,可以有效排除干扰离子,提高蛋白质的定量准确性。
PRM技术较传统的Western blot、ELISA等靶向蛋白验证技术具有如下优势:
1. 克服了抗体制备难,买不到抗体的困境。
2.PRM技术与DIA/iTRAQ/TMT技术都是基于质谱技术,对于组学的结果验证率有很大改善。
3. 一次针对30个左右的目的蛋白进行精确靶向定量。
PRM技术优势
PRM和DIA各自都有这么多优势,那将这2个前沿的技术合起来使用会是什么样的效果呢?显而易见,合起来使用,你不仅可以享受到给各自的优势,还具备PRM验证可使用DIA的数据库资源,也就是说不用重复建库,一个数据库就搞定(PS:省了一笔重复建库费用);另外,PRM验证让您不再忧愁各种途径找定制化抗体。
那么DIA+PRM技术能够适用哪些研究呢?答案是各领域均适用,尤其适合临床医学样本,强力推荐。
DIA+PRM技术讲座
时间:7月26日
地点:线上讲座
主讲人:徐燕
主讲人简介:上海交通大学系统生物医学研究院毕业,研究方向疾病蛋白质组学,学位论文为脓毒症血浆外泌体的分离提纯及其蛋白质组研究,并以第一作者在Biochemical and biophysical research communications上发表SCI论文。
讲座简介:1、蛋白组学技术概括 2、DIA技术+PRM技术简介 3、技术研究思路及文献挖掘 4、DIA、PRM技术研究流程 5、投稿推荐等干货内容
欢迎添加微信申请免费讲座和课件
1 前言
Early B cell factor 1(EBF1)是协调B细胞谱系发育所需的关键转录因子之一。尽管研究表明Ebf1单倍剂量不足(haploinsufficiency)参与白血病的发展,但尚未表征Ebf1杂合性对pro-B淋巴细胞蛋白质组的全局影响。来自德国弗莱堡马克斯普朗克免疫生物学和表观遗传学研究所Gerhard Mittler团队,通过DDA(data dependent acquisition)和DIA(data independent acquisition)质谱技术鉴定Ebf1+/+ and Ebf1+/-细胞系间的差异表达蛋白,发现DIA鉴定结果无论是蛋白鉴定数目还是得到的差异蛋白数目,均要优于DDA鉴定结果。
2 基本信息
中文标题:蛋白质组学DIA+PRM技术研究Pro-B淋巴细胞Ebf1杂合性
发表日期:2018.1.5
发表期刊:J Proteome Res.
主要运用技术:DIA+PRM
3 结果分析
图1 | 比较DDA和DIA方法鉴定到的肽段、蛋白质和差异蛋白数量
接着该团队选择了5种差异蛋白(EBF1, Pax5, TCF3, BCL2 and TNPO3)进行PRM(Parallel Reaction Monitoring)验证,验证结果与DIA结果相吻合。结果表明与EBF1相似,其他B细胞谱系调节因子(例如TCF3和Pax5)的表达也在Ebf1杂合细胞中下调。此外DIA差异表达蛋白的功能性分析显示,EBF1杂合性导致至少八种参与淋巴细胞生成的转录因子的失调,并且导致在pro-B淋巴细胞的存活、发育和分化中起作用的关键蛋白的失调。
图2 | 候选蛋白的PRM相对定量验证结果
4 参考文献
Musa YR et al. Comprehensive Proteomic Investigation of Ebf1 Heterozygosity in Pro-B Lymphocytes Utilizing Data Independent Acquisition. J Proteome Res. 2018 Jan 5;17(1):76-85.
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实例分析
由JAK2V617F变化引起的蛋白质组学分析
基本信息
材料:Ba/F3细胞系 主要技术:SILAC、iTRAQ
期刊:Leukemia. 影响因子:12.105
文章摘要
超90%的真红细胞增多症患者都存在JAK2,JAK2V617F的突变,这些突变基因的蛋白产物为临床治疗提供了重要的潜在靶点,但是目前JAK2抑制剂在临床治疗上并不成功。为了提高临床疗效和加深这些原癌基因在造血细胞中的作用,文章通过SILAC技术和iTRAQ技术检测到了受JAK2V617F基因影响的5000多种蛋白和2000多个核内磷酸化位,这些蛋白影响了p53和MYC信号通路,并通过JAK2V617F突变的临床病人的原代CD34+细胞进行了深入验证,同时抑制MYC和上调p53能够有效的清除JAK2V617F阳性的CD34+细胞,这为临床治疗提供了另一种思路。
方法流程
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本文是通过蛋白质组学研究分子机理的典型文章。不同于一般研究的地方在于采用了两种标记蛋白质组学联合检测和分析,同时研究对象不局限于全细胞,还扩展至细胞核,检测的蛋白不局限于普通蛋白,同时也检测磷酸化修饰蛋白。着手点比较多,通过对数据的整合分析,层层递进,蛋白质组学研究方法可以很好满足此类研究的需求。
文献来源
Stella Pearson. et al., Proteomic analysis of JAK2V617F induced changes identifies potential new combinatorial therapeutic approaches. 2017, Leukemia.
DIA+PRM 定量蛋白质组技术 ,DIA+PRM
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前言 2019年11月,英国剑桥大学生物化学系和米尔纳治疗学研究所(Department of Biochemistry and The Milner Therapeutics Institute, University of Cambridge)等多家机构在一区期刊nature methods(IF=28.467)发表题为“DIA-NN:通过神经网络和干扰校正实现高通量蛋白质组的深度覆盖”的文章,该文章作者提出了一种方便的集成软件包DIA
提问:什么是PRM技术?PRM:平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring) 是一种基于高分辨、高精度质谱的离子监视技术,能够对目标蛋白质、目标肽段(如发生翻译后修饰的肽段)进行选择性检测,从而实现对目标蛋白质/肽段进行相对或绝对定量。PRM技术是基于质谱的靶向验证蛋白组学技术,完美的替代了基于抗体的Western blot、ELISA等。PRM技术运用平行反应监测技术特异性地选择与预先设定质荷比相同的肽段离子并进行定量,可以有
前言 2019年12月,四川农业大学林学院课题组发表题为“Differential Proteome Analysis of Hybrid Bamboo (Bambusa pervariabilis × Dendrocalamopsis grandis) Under Fungal Stress (Arthrinium phaeospermum)”的研究论文,该研究报道了在真菌胁迫下,杂种竹生长过程中,与自身抗性相关的蛋白表达受到显著影响。本文
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关键词:蛋白质组学 随着质谱仪器的不断更新换代,蛋白组学的技术也不断的革新,从最早的2-D电泳技术到基于LC-MSMS的蛋白定性;从Labelfree 技术到标记定量iTRAQ/TMT技术以及时下备受推崇的DIA/SWATH技术、PRM/MRM技术,每一次的技术革新都使得蛋白组学研究更上一阶。关键词:蛋白标记定量技术 iTRAQ/TMT技术 当下蛋白组学研究中应用最广泛的技术是同位素标记定量(iTRAQ/TMT技术
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如今,蛋白组学的研究大多都是利用基于质谱的bottom-up的方法进行研究,其中最为常见的是基于高效液相色谱的鸟枪法。LC-MS/MS具有强大的蛋白定性能力,但是在定量上其灵敏度仍有待提高。近年来,基于质谱的多重靶向蛋白质组学技术,在蛋白精准定量上的展现了更高的灵敏度以及良好的重现性。选择反应监测(selected reaction monitoring,SRM)是靶向蛋白组学的金标准,平行反应监测 (Parallel reaction monitorin
基本信息文章标题:Quantitative Profiling of Protein Tyrosine Kinases in Human Cancer Cell Lines by Multiplexed Parallel Reaction Monitoring AssaysPRM对不同癌症细胞系中酪氨酸激酶的相对定量分析期刊:MCP发表日期:2016IF:5.232研究对象&意义:PTK蛋白酪氨酸激酶(PTK)在细胞信号转到细胞周期调控、分裂、分化等方面存
前言PCT-SWATH:高压循环-卫星扫描质谱技术PCT技术(Pressure Cycling Technology),在由程序设定的超高压和标准大气压之间的循环能够诱导基质和蛋白质的溶解,促进和加速蛋白质水解,可用于蛋白质组样品的制备。对于临床样本,PCT也可以灭活潜在的污染传染性微生物,能够在最大程度上还原样本的原始状态。SWATH技术(Sequential Window Acquisition of all Theoretical frag
前言数据非依赖采集(data independent acquisition,DIA)是近年来备受瞩目的质谱采集技术之一,一度引领了定量蛋白质组学新发展。小鹿今天就跟你聊一聊DIA技术中重要部分:DIA数据采集窗口该如何设置呢?固定窗口图1 | 固定窗口采集示意图假设500m/z到900m/z的扫描范围,分成四十个窗口,那么每个小窗口固定的是10m/z,纵坐标为保留时间,固定的保留时间扫描固定质荷比的离子,一一对应的关系,那么整个梯度下来,就能涵盖整个所有
前言数据非依赖采集(data independent acquisition,DIA)是近年来备受瞩目的质谱采集技术之一,一度引领了定量蛋白质组学新发展。DIA 是一种靶向蛋白质组学技术,其对选定质荷比(m/z)范围内的所有离子进行碎裂和二级质谱分析。DIA 是数据依赖性采集(Data-dependent acquisition, DDA)的替代方案,DIA 相比于 DDA 的最大的优势在于高效测定复杂样品中丰度极低的蛋白分子,极大地提高了定量
中文名:数据非依赖性采集外文名:Data-independent acquisition简称:DIA领域:质谱DIA是一种靶向蛋白质组学技术,其对选定质荷比(m/z)范围内的所有离子进行碎裂和二级质谱分析[1]。DIA是数据依赖性采集(Data-dependent acquisition, DDA)的替代方案,有更高的定量准确性和可重复性。DIA原理液相色谱与串联质谱(LC-MS/MS)相结合的技术成为蛋白质组研究的主要研究手段。在自下而上的蛋白质组学中,
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