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磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)比色法,主要用来检测细胞增殖情况。SRB是一种粉红色阴离子染料,易溶于水,在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合; 在540 nm波长下产生吸收峰,吸光值与细胞量成线性正相关,故可用作细胞数的定量检测。SRB染色后不会像MTT法那样很容易变色,细胞固定染色后在96孔板中 可以放置较长时间,因而受测定时间的影响较小。用Tris-base溶液溶解的SRB也可稳定较长时间。因此不同时间点固定的96孔细胞培养板可在同一时 间测定,测定的吸光值结果不会受到明显影响。吸光值与SRB浓度作图时,在OD单位1.5—2.0以下为线性,当超出线形范围时,zei好稀释后重新读数。虽 然SRB法比其他检测方法操作步骤繁琐,但是由于时间可以自己掌握,不受限制,因此适用于高通量筛选。
操作步骤
1. 细胞固定:药物作用时间终点时,每孔加入50μL4℃预冷的TCA溶液(30%,w/v)固定细胞,TCA溶液的终浓度为10%。静置5 min移入4℃冰箱中固定1 h,取出用去离子水冲洗5遍,室温晾干。
2. 染色:待96孔板室温下晾干后,每孔加入0.4%(w/v)的SRB染液(1%的乙酸配制)70μL,染色30 min后倒掉染液,用1%(v/v)乙酸冲洗4次,去除未结合的染料,室温晾干。
3. 检测:用100μL非缓冲Tris-base碱液(10mM,pH=10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料,水平摇床上振荡20min,采用酶标仪 540nm处测定光吸收值。操作中,应注意洗除染料时操作需迅速,避免用移液器吸取液体,防止动作过慢造成与细胞蛋白结合的染料解吸附。
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