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1. Cas9导入细胞方法:尝试各种方法,如脂质体类转染、电转、慢病毒感染、腺病毒感染等,确定高效导入Cas9方法。
2. 药物浓度预实验:降低后续阳性克隆筛选和检测工作难度。
3. 单克隆培养情况:观察细胞是否可以单克隆培养。
1. 靶点设计
一般在不同转录产物的共同外显子上设计3个靶点,靶点位置尽量在基因CDS的前1/3,ATG之后,zei好能破坏重要的domain和所有的转录产物isoform。第一批合成构建3个,效果不佳或时间紧张的可一次构建6个。
2. 载体构建和病毒包装
根据预实验结果,选择合适的普通载体或病毒载体,吉满生物现拥有3类载体:普通Cas9载体、慢病毒Cas9载体和腺病毒Cas9载体。
3. 内源活性筛选
转染细胞或感染细胞48H后,使用Puro或Blasticidin筛选48H,提取基因组DNA。使用T7E1酶验证打靶载体的活性。将有效的突变型PCR产物测序验证。
4. Donor载体(基因敲入)
根据筛选的gRNA靶点位置,构建Donor普通载体或腺病毒载体。共转染/感染 Cas9-gRNA和Donor.
5. 单克隆筛选
无限稀释到每孔1个细胞的数量,每株细胞铺至少2个96孔板。细胞长好够,验证内源活性并送测。
6. 获得突变型
如需纯合子,则可能需要重复步骤3-5。
相关产品链接:
CRISPR/Cas9基因敲除试剂盒
Cas9质粒构建
Cas9腺病毒服务
Cas9慢病毒服务
细胞基因敲除(敲入)全套服务,
细胞基因敲除(敲入)全套服务信息由吉满生物科技(上海)有限公司为您提供,如您想了解更多关于细胞基因敲除(敲入)全套服务报价、型号、参数等信息,欢迎来电或留言咨询。
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