文献分享 | 关于拟南芥中生长素的代谢组学的特异性分析

生长素作为一个形态发生器，调节植物关键的生长和发育过程，研究者们认为生长素几乎影响植物生长发育的各个方面；有丰富的遗传学证据表明，生长素的合成和降解存在多种途径，而这些代谢途径的复杂性使得我们很难清楚地了解在发育过程中特定代谢途径的相对重要性，吲哚-3-乙酸水平是如何通过多重降解和可逆或不可逆共轭途径调控的，我们知道的也很少。能够精确定量各代谢途径上关键物质对于了解植物生长发育过程起着关键作用。今天给大家分享一篇发表在The Plant Journal（IF= 6.141）上的关于生长素的文章：Tissue-specific profiling of the Arabidopsis thaliana auxin metabolome。

生长素通常是在细胞质中合成，而且是经由色氨酸代谢产生，公认的拟南芥中生长素合成和降解通路如下图1：

图1 公认的拟南芥中生长素合成和降解通路

吲哚-3-乙酸代谢物的化学差异性过大，一些方法只能测定很少的代谢产物，作者采用SPE一步纯化方法与灵敏度高、选择性好的液相色谱-多反应监测-质谱(LC-MRM-MS)相结合，能够精确测量21种化合物。

1.方法开发过程

1. 实验部分

• 稳定性

作者测试了吲哚-3-乙酸代谢产物在不同溶液中的稳定性，最终得出大部分IAA代谢物或者结合物在比较宽的PH范围条件下都比较稳定，吲哚-3-丙酮酸、吲哚乙醛肟极不稳定，同时作者还测试了不同的浓缩方法：真空浓缩、氮气吹干，最后得出在真空条件下色氨酸和吲哚-3-乙醛会降低10%-30%。各物质稳定性结果如下图2：

图2 各物质稳定性结果

• 衍生

对于容易降解的两个物质吲哚-3-乙醛、吲哚-3-丙酮酸，作者采用了衍生的方法，使用衍生试剂巯基乙胺，此衍生剂的衍生产物对比其他衍生产物灵敏度更高；作者在一半的提取液中加入3ml，0.25M的巯基乙胺（PH=8），常温反应1h，然后过SPE柱，纯化。反应原理及子离子图如下图3：

图3 吲哚-3-乙醛、吲哚-3-丙酮酸衍生原理

• 提取试剂

作者测试了四种不同的提取液：80%甲醇溶液、70%丙酮溶液、异丙醇/磷酸钠缓冲液（PH=7）=2:3、磷酸钠缓冲液（PH=7），在提取后使用研磨仪25HZ研磨3min，使用Oasis HLB (30 mg) SPE 小柱纯化，对比结果发现几种提取液提取效率一样，但是不含有机试剂的缓冲液能够较少地提取色素、脂质等对接下来分析有影响的物质，所以提取液作者选择的是磷酸钠缓冲液。

• 纯化

对于SPE柱，作者测试了硅胶填料的SPE柱（C8）和高分子聚合物填料的SPE柱（HLB），因为HLB的回收率更高，对极性化合物保留效果更好，作者选取了HLB小柱，之后作者优化了SPE萃取小柱的上样溶液的PH值，发现在酸性条件下，生长素类代谢物回收率更好，对于基质效应，作者经过测试发现在0mg、10mg、20mg样本的提取效率分别是85%、60%、50%。最终实验过程如下图4：

图4 实验流程图

2. 仪器部分

作者采用MRM正离子采集模式，结合超高效液相色谱与KinetexTM色谱柱分离条件，在13min色谱梯度下完成对生长素21个物质的检测，作者同时评估了方法的精密度和准确度，方法精密度0.3-16.5%，方法准确度-23.8-19.3%。具体色谱分离情况如下图5：

图5 所有物质色谱分离图

2.方法验证

1. 实验结果

为了验证方法的有效性，作者通过评估3个野生型拟南芥（Col-0, Ws and Ler）和3个生长素高产变异型（35S:YUC1 ，sur1-3，sur2-1）中的生长素代谢物的水平，发现生长素高产株系sur1-3和sur2-1与Col-0株系相比具有统计学差异，在3个突变系中，iasp、IAGlu和oxIAA水平均显著升高，表明IAA结合和IAA分解代谢均在这3个突变系中发生。IAA在根和芽的代谢模式与之前发表的野生型Col-0和IAA过度产生突变株的代谢模式一致，野生型和突变型的IAA水平也与先前报道的生长素高产突变株35S:YUC1 (Stepanova et al.， 2011)、sur1-3 (Boerjan et al.， 1995)和sur2-1 (Barlier et al.， 2000)的结果一致。具体结果如图6：

图6 拟南芥中生长素类物质在野生型和突变型的代谢分析

2. 数据分析

为了结果可视化，作者做了基于PCA的biplots图，如下图7、8，结果显示了三种生态型的根和芽有明显的代谢物差异，组织之间差异性不明显，同样，在模型中，突变系是根据基因型而不是组织类型分离的；总的来说，该分析表明，代谢物数据的无监督多变量建模是数据分析和可视化的重要辅助工具。综上所述，诱导IAA高产突变株系对干扰植物的IAA代谢是非常有用的，可以作为更好地了解植物的代谢过程的一种途径。

图7 PCA图（1）

图8 PCA图（2）

本篇文章作者开发了一种具有高灵敏度敏感和高选择性的方法来对IAA及其前体和代谢产物进行定量，使得在少量的拟南芥组织中分析IAA代谢及其相关代谢物成为可能。通过对野生型和IAA高产株系的分析，结合多变量数据分析，验证了该方法，表明作者开发的技术有可能提供更深入了解生长素代谢是如何调控的。