人物专访 | K. Dreisewerd 教授 | 化学显微镜的开发历史

MS 和 MS

MS和MS这两个缩略语已经有很长一段时间了。一种是Münster的缩写，另一种是质谱的缩写。

20世纪80年代末，在明斯特大学，Franz Hillenkamp和Michael Karas开发了“基质辅助激光解吸/电离质谱法”—简称MALDI MS。互联网上一直有传言说，这两位研究人员的研究成果差一点被授予2002年诺贝尔化学奖。正如Klaus Dreisewerd教授和Jens Soltwish博士在他们今年发表在《分析化学》杂志上的文章中详细描述的那样，由两人领导的工作组延续了Münster的MALDI MS先驱的传统，并对该方法进行了重要的改进[1]。

早在2015年[2]，该团队在MALDI技术上取得了决定性突破和进展，自2020年5月以来，该技术已成为布鲁克·道尔顿商品化“timsTOF fleX MALDI-2”系统的核心部分。这项新技术代表了质谱性能的巨大进步。

鉴于以上原因Wiley Analytical Science（WAS）的编辑与Dreisewerd教授详细讨论这种方法的开发和优势。

Q1

是什么原因让您深入研究MALDI，开发了MALDI-2质谱成像技术--“化学显微镜”？

K. Dreisewerd：在生命科学的许多问题中，对如组织切片、活检或细胞培养样本的局部化学成分的精确了解，对结果有决定性的影响。一个例子是肿瘤细胞异质性影响可能的恶性生长，它有非常重要的医学意义。与传统的光学显微镜相比，荧光标记用于单个生物分子蛋白质的可视化，MALDI质谱成像可以同时显示多达数百个不同生物分子的分布。这是通过测定每个分子的原子组成和质量得到。MALDI成像的标准分辨率目前约为10微米，尽管这一分辨率正在不断提高。MALDI质谱成像近年来发展迅速，至少在新技术方面。然而，这项技术在研究和诊断中能获得更广泛应用的障碍是许多种类分子的离子化效率很低，而只有电离的分子在质量仪上才能被测量，大部分没有电离（中性）分子损失了。这意味着改进MALDI的电离过程非常必要。这就是我们的激光诱导后电离（简称MALDI-2）为什么会产生。

Q2

MALDI-2-MS 最重要的特点和系统配置是什么样的？

K. Dreisewerd: 在成像测量中，用MALDI激光对涂布了MALDI基质的样品进行逐点扫描。并记录每个扫描点（即像素）完整的质谱图。然后，计算机从众多离散离子信号中计算绘制分子的分布图像，这些信号就是分子的精确分子量。

正如我们现在知道的，在“二次”MALDI电离过程中，第一次“MALDI激光”产生的中性物质必须满足一些关键的边界条件，才能进行有效的后电离。例如，粒子的膨胀和与第二束激光的相互作用应该在数毫巴的氮气环境中进行。在这些条件下，与在正常MALDI中发生的高真空膨胀相反，分子羽流的速度大大减慢，并“聚集在一起”。也可能发生再凝聚效应，即形成小雾滴。结果是你得到了一个反应体积，在这个体积中，经过后电离激光的轰击，带电粒子和中性粒子之间的大量碰撞会产生所需的最终产物——完整的带电分析物分子。从技术角度来看，使用足够短波长的激光是有帮助的，这样，由于两个光子的连续吸附，一个电子实际上是在几纳秒内从基质分子中被夺走的。紫外波长266nm的高性能的Q-切换Nd:YAG激光器尤其适合于此。当然，还需要优化两个激光束之间的延迟和空间距离。最后离子源应与合适的质量分析器相结合。

我们与布鲁克·道尔顿合作，将MALDI-2技术集成到高端MALDI离子淌度质谱仪timsTOF fleX。这套质谱系统不仅可以在ppm水平高精度地测定质量，还可以通过离子迁移率，分离质量相同但结构不同的异构体分子。在新的timsTOF fleX MALDI-2中，使用频率为1kHz的Nd:YAG后电离激光器，可实现每秒10-20像素的快速数据采集。这意味着可以在高空间分辨率的情况下同时获得相对高的分析通量。

Q3

除了使用新的MALDI技术，新的高性能质谱仪有哪些功能？“化学显微镜”的工作流程是怎样的？

K. Dreisewerd: 通过使用专门设计的后电离激光，可使许多类型分析物的检测限提高三个数量级。通过这种方法，许多物质可以通过MALDI成像第一次被发现。一个典型的例子是甾醇如胆固醇，作为非极性脂类，很难被正常的MALDI检测出来，除非用衍生化方法。我们在许多实验中观察到，timsTOF fleX的各种特点与MALDI-2高离子化相结合，可以对科学问题产生新见解。

改进的检测灵敏度也使我们能够获得有意义的质谱图，即使是很少的样本量。利用特殊设计的光学器件，我们得到了空间分辨率约为1微米的MALDI-2图像，已在最近的《自然》方法中发表[3]。这个分辨率就可以对单个细胞分析其分子组成，特别是从细胞培养的角度。这对于细胞生物学领域的许多课题研究都具有重要意义。

MALDI-2和MALDI的工作流程是相同的，只需打开附加的激光器即可。

Q4

开发MALDI-2技术的主要困难是什么？在实现过程中，需要考虑和克服哪些技术困难？花时间最多和最关注的有哪些？

K. Dreisewerd：MALDI-2的研制是我们团队数十年研发工作的成果。多年的持续不懈使我们能够把各方面的积累汇合并最终取得了成就。2014/15年我们在一个特殊配置上得到了最后的突破，我们被MALDI-2的效果及其带来的机遇深受鼓舞。

Q5

MALDI-2这种成像技术主要适用于哪些研究或应用领域？哪些物质可以被定位和检测？其灵敏度和准确度如何？

K.Dreisewerd：潜在的应用范围相当广泛，从生物化学、生物学到医学研究和临床应用。MALDI成像技术也越来越多地应用于食品化学领域，因此我也希望看到后电离方法带来的巨大好处。然而，就许多应用和物质种类而言，目前我们仍处于一个令人兴奋的发展早期。但是，可以肯定的是像脂类，例如刚才提到的甾醇以及磷脂、糖脂和脂溶性维生素都可以用MALDI-2进行灵敏度增强检测。这也适用于更多的小分子，如次级代谢物。初步研究还表明，某些重要类别的药物可以被更好地检测[4]。这当然是在医疗健康中特别重要的应用。例如，在利用MALDI-2开发药物时，制药公司可以更好地了解药物在靶器官中的分布情况，以及可能产生的代谢产物的情况。由于它们的质量发生了变化，所以可以用质谱法来检测，而其他技术是无法检测到的。

Q6

我们知道明斯特是MALDI-MS的发源地。明斯特大学的经验在多大程度上促进了这项新技术的发展？

K. Dreisewerd：我们的团队是由Franz Hillenkamp和Michael Karas领导的工作组发展而来的，他们是MALDI的发现者。尽管我们在不同的研究所工作。如果没有特别的知识和一些特别的实验室设备，我们现在的突破是不可能的，可以说，这些设备经历了几代学生长久的使用和传承。过去和现在都非常重要的两件事是完整的集体性和团结一致的团队。多年来，团队中的副教授Jens Soltwish博士和几个独立研究项目负责人在推进包括MALDI-2及目前的发展起到了决定性作用。

Q7

您的工业合作伙伴布鲁克·道尔顿是怎么意识到您的“化学显微镜”概念？是什么时候开始又是怎么合作的？

K. Dreisewerd: 布鲁克被认为是MALDI质谱分析领域的全球市场领导者，我们已经认识多年了。我曾在布鲁克指导过以前的一些同学和博士生的工作。就MALDI-2技术而言，我认为我们在2015年发表的《科学》杂志改变了传统规则[2]。之后，我们又发表了一系列文章，包括MALDI-2的应用和基础研究结果。我们在很多国家和国际会议上展示了这些结果，在这些会议上有很多讨论的机会，尤其是与布鲁克·道尔顿研发部负责人Jens Höhndorf博士的讨论，他负责MALDI产品的开发。我们之间的交往从一开始就很好。在某种意义上，这个全新概念是共同创造的结果。

Q8

timsTOF fleX MALDI-2 将批量生产，已在今年5月底、6月初的第68届美国质谱年会上（ASMS）发布。从设想到样机到仪器最后的商品化，用了多长时间？在休斯顿产品发布时你有什么感受？

K. Dreisewerd ：在决定共同开发产品和明确有关事项后，一切进展都非常迅速，并且这是重点。我们总是把5月底的ASMS会议作为我们推出产品的最后期限。实际上我们能够在大约12到14个月内做出产品。在此期间，还有很多事情：必须解决理论方面的问题、优化性能数据、作广泛的应用测试和解决一些基本问题。这只有通过非常优秀团队的合作才能变为现实。我们这里除了Jens Soltwish外，荷兰莱顿大学医学中心的Bram Heijs是明斯特大学的访问学者，他在实验室的样品测试中发挥了主导作用。

布鲁克·道尔顿在德国不来梅，我发现和明斯特相距不远，火车不到1个半小时，这意味着当天来回的短时间工作不是问题，这方便了我们的合作。另外，为了和控制新冠疫情接轨，明斯特大学医院和我们作为一个团队，在很早的时候就制定了卫生防疫和工作时间管理计划。基本上，这些措施和所有人员的应变能力意味着我们能够在没有时间耽误的情况下完成所有的开发工作。

对我们学者来说，一个重要的方面是我们与不来梅的同事在产品正式发布之前，能够在著名的《分析化学》期刊上详细描述timsTOF fleX MALDI-2的基本原理及其所带来的机遇[1]。这篇文章在ASMS年会召开前的几天上线，所以时间衔接的非常好。

因为新冠疫情，产品发布在网络上进行。这当然不同寻常，我强烈地感觉到不能直接地与我的同行讨论。但除此之外，我依然很兴奋与行业领导者一起，让MALDI-2变为现实，并让其他研究人员和实验室使用。

Q9

您和您的合作伙伴对未来MALDI-2进一步开发有什么目标？

K. Dreisewerd：目前，我无权透露我们和合作伙伴可能达成目标的任何细节，但可以说未来肯定还会有更多的目标。为了评估和确定MALDI-2的分析潜力，我们已经与来自不同国家的许多同行进行多方面合作。我现在可以保证的是，在不久的将来会有一些很好的结果。关于仪器和方法学，我们的团队在未来几年有一些主要的目标，包括进一步提高空间分辨率（低至亚微米范围）以及与正交技术（如光学显微镜）的连接。再回到我前面提到的持续性问题：除了成像之外，MALDI还有另一个重要的应用领域。在过去的几年里，革命性的微生物诊断是MALDI对生物分型。这种方法使快速鉴定细菌、真菌和一系列其他微生物成为可能。在过去的十年里，这项由布鲁克开发并工业化的技术已经取代了以前使用的方法，现在已经成为临床诊断的一个重要手段，因为它比传统的微生物或基因组学方法提供更快和更精确的结果。

然而，在我看来，和生活中几乎所有的事情一样，它的潜力还远未被充分开发。我们可能是世界上唯一的MALDI开发实验室，并在2012年与明斯特大学卫生研究所下的一个引领微生物研究的部门整合。多年来，我们的研究所所长Helge Karch教授很早就认识到MALDI技术具有很高的跨学科潜力，如果没有他的全力支持，我们肯定无法达到现在的水平。在更多的MALDI-2质谱仪的帮助下，我们最近展示了MALDI-2成像技术如何有助于更好地理解感染过程的糖生物学和细菌群落中的化学通讯。我希望在将来利用这一潜力，继续改进并且大大加快医院有害病菌的鉴定。也许这些研究甚至可以在识别新的急需抗生素方面发挥作用。面对新冠病毒，我们很容易忘记医院多重耐药细菌日益严重的问题，而且几乎可以百分之百的肯定，未来的疫情爆发会来自于细菌病原。

Klaus Dreisewerd 教授

曾在亚琛工业大学和明斯特大学物理学专业学习。他在Franz Hillenkamp和Michael Karas的研究团队中完成了博士论文，帮助开发早期的MALDI技术。1997年，他回到阿姆斯特丹大学做博士后。Klaus和他的跨学科研究小组一起，一直致力于MALDI技术研究开发，从物理基础理论、仪器方法学到新的应用。目前担任德国明斯特大学卫生研究所生物医学质谱中心负责人。

参考文献

[1] J. Soltwisch, B. Heijs, A. Koch, S. Vens-Cappell, J. Höhndorf, K. Dreisewerd: Anal. Chem. 92, 13, 8697–8703 (2020), doi [10.1021/acs.analchem.0c01747].

[2] J. Soltwisch, H. Kettling, S. Vens-Cappell, M. Wiegelmann, J. Müthing, K. Dreisewerd: Science 348, 6231, 211-215 (2015), doi: [10.1126/science.aaa1051].

[3] M. Niehaus, J. Soltwisch, M. E. Belov, K. Dreisewerd: Nature Methods 16, 925–931 (2019), doi: [10.1038/s41592-019-0536-2].

[4] [4] F. P. Y. Barré, M. R. L. Paine, B. Flinders, A. J. Trevitt, P. D. Kelly, R. Ait-Belkacem, J. P. Garcia, L. B. Creemers, J. Stauber, R. J. Vreeken, B. Cillero-Pastor, S. R. Ellis, and R. M. A. Heeren: Anal. Chem. 91, 16, 10840–10848 (2019), doi: [10.1021/acs.analchem.9b02495].