赛默飞与合作实验室成功开发标准化HRMS1-DIA方法

2020-10-28 14:40 赛默飞色谱与质谱分析

Orbitrap 蛋白质组学

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癌症Moonshot计划启动后，出现了许多精准医学项目，该计划旨在通过改善早期发现，患者分类以及监测治疗效果和复发来增强癌症患者的管理，从而加速癌症研究。有关蛋白质型的信息，定义为蛋白质组的实际状态，其数量，时间和空间的表达以及与基因型的相关性（所谓的蛋白质组学），将大大增加我们对包括癌症在内的各种人类疾病的理解。在这一过程中，迫切需要一种质谱分析策略，以提供可靠且可重现的定量数据。

Orbitrap已经成为蛋白质组学实验室的金标准，赛默飞全球高级产品经理轩玥博士联合多个实验室瞄准数据非依赖性质谱采集（Data-independent acquisition，DIA）的非标记定量蛋白质组方法，用于支持精准医学的高通量临床蛋白质组学分析。作者首先建立了高通量、简化的HRMS1-DIA工作流程，该工作流程在随后的11个实验室中连续7天测试和集中的数据处理；开发了一种质量控制（QC）系统，以监视整个工作流程的性能，即时发现仪器性能的变化，并在必要时指导故障排除，确保维持较高水平的数据质量，以实现大型临床队列研究所需的通量；在整个研究过程中，每个实验室都使用一套完善的非标记定量样品对定量性能进行评估，从而可以进行分布式和纵向数据分析，并可以在大数据分析时进行比较和标准化。

简化的HRMS1-DIA工作流程进行数据采集和分析

▷鉴定QC:

PierceTM Hela Protein Digest Standard

▷定量QC:

Sample A(20%E.coli,15%Yeast和65%Hela),

Sample B(4%E.coli,30%Yeast和65%Hela)

▷色谱条件:

ES806(Acclaim PepMap RSLC C18, 2 µm,100 Å,150 µm i.d. × 150 mm),

60min色谱梯度，流速1.2µL/min

▷质谱:QEHF

▷DIA数据采集方法:

HRMS1-DIA，1个cycle包括3个R120K MS1扫描，每个MS1扫描之间穿插18个15 Da 隔离窗口的R30K DIA MS / MS扫描（总共54个DIA MS/MS扫描）。高分辨的一级用于定量分析，二级用于肽段鉴定。此处采用的HRMS1-DIA方法中，MS1扫描周期速率（1.7s）与MS2循环时间无关，可确保有足够数量MS1扫描的数量保证定量的重现性。相比之下，MS2采集时设置相对较窄15Da的隔离窗口，能够最大限度的提高肽检测效率。

▷数据分析:

11个实验室的数据统一上传至Thermo Cloud云平台，SpectronautTM软件提取DIA色谱峰。

HRMS1-DIA实验流程（点击查看大图）

鉴定QC质控标准

每个实验室根据鉴定QC进行系统质控，作者提出了多个质控的指标，蛋白质组学实验室可以作为参考，包括色谱的峰宽、MS1和MS2采集的点数、Precursor和蛋白数目以及定量的CV。只有符合QC相应的指标才能继续实验。如果不满足条件，需要排查是色谱问题还是质谱问题。

定量QC的质控

定量QC的目的是考察HRMS1-DIA定量流程的准确性，SampleA/B中Hela的理论比例是1:1，Yeast是1:2，E.coli是4:1。作者提出了两种方法对定量QC进行质控：

（1）定量真实比值与理论比值的偏差，不超过25%；

（2）定量的重现性，CV小于25%。

HRMS1-DIA的重现性

Sample A和Sample B在11个实验室进行7天的数据采集，一共产生了240个DIA数据，共鉴定超过7600个蛋白，其中4000个人蛋白，2000个酵母蛋白以及400个E.coli蛋白。首先看单个实验室7天内定量的重现性，平均每个实验室每天均可以分别定量超过6500个蛋白；然后看实验室间的重现性，5784个蛋白被每个实验室定量到，4564个蛋白被每个实验室每天定量到。