Serum peptide profiling for potential biomarkers in early diagnosis of Escherichia coli bloodstream infection

血流感染早期检测的必要性

血流感染是临床上常见的全身感染性疾病，其病原菌包括细菌、真菌、病毒等，其中细菌性血流感染占大部分。近年来，由于抗菌药物的滥用，激素、免疫抑制剂的不合理应用和大量侵入性诊疗技术的开展，血流感染发病率逐年升高。可进一步发展为脓毒症或脓毒症休克，严重威胁患者的生命。数据显示，1990年至2007年，国外血流感染比例从2%提升至4.7%，我国血流感染病例数在此期间也升高约两倍，而感染致死率在22%-45%之间。因此，血流感染的早期诊断和及时治疗等研究显得尤为重要。

现有临床血流感染检测的局限性

当前血培养是诊断血流感染的金标准，但是血培养所需时间长、阳性率低，不能在血流感染的早期提供充足的诊断依据给临床。而近年来出现的多种病原菌基因检测技术虽然可在一定程度上较为早期的检出致病菌，但由于血流感染早期菌量较少，检测菌类较少，成本高等不足，至今为止并未应用于临床血流感染常规检测。另外，基于蛋白质检测的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry）方法虽然已应用于临床常规微生物鉴定多年，但因其处于检测流程中血培养步骤的下游，所以也无法用于早期检测。所以合适的血流感染检测生物标志物仍是临床一项重要的需求。

早期血流感染生物标志物的探索

一直以来，早期血流感染生物标志物的研究并未出现很大进展，最主要的原因在于临床患者感染时间未知，因此无法对患者进行严格的对比。而近日发表于Cytokine期刊的一篇研究，中国人民解放军总医院临床检验科主任王成彬教授及其团队对寻找有效的早期血流感染标志物进行了深入的探索。该团队构建了血流感染的小鼠模型，在全球开创性地结合毅新博创自主开发的Clin-TOF II以及LC-MS/MS等质谱平台对早期血流感染引起的血液中多肽的变化进行了研究。该研究使用ICR小鼠（25-27g），分别在尾部注射感染大肠埃希菌后1，3，6，12，24，48，96和128小时进行采血并分离血清，每个时间点使用10只小鼠。对照组小鼠则使用PBS进行注射。在尾部注射6小时后，所有大肠埃希菌感染小鼠均出现精神萎靡，活动减少，体重减轻等症状， PBS对照组小鼠表现正常。而MALDI-TOF质谱结果显示，血清中1000-10,000 Da范围内的蛋白质多肽共有17个谱峰存在显著变化(p < 0.01)，与PBS对照组相比，感染组中有7个峰的峰高明显降低，另外10个峰则有所升高。

图1：感染组与对照组血清中的差异性多肽峰。A是7个在感染组小鼠中含量水平降低的7个多肽峰；B和C代表感染组中10个显著增高的多肽峰。所有结果均表示为平均值±标准差。x轴：分子质量电荷比（m/z）；y轴：平均强度。

该研究然后使用LC-MS/MS串联质谱对血清中的多肽进行了进一步的鉴定，发现MALDI-TOF中m/z为1941、2914.1、4126.9的谱峰所对应的蛋白质分别为血清铁传递蛋白 (Serotransferrin, TRF)，补体C3 (Complement C3, C3)和血清淀粉样蛋白A-1 (Serum amyloid A-1, SAA1)。血清铁传递蛋白与细菌感染具有密切关系。铁离子在生物氧化过程中起着重要作用，在体内大部分真菌和细菌通过铁配体转运，然后被血红蛋白、血红素和转运蛋白吸收。因此，血流感染患者的细菌在生长繁殖过程中会大量捕获外周血内的游离铁离子，随着血清中铁离子的消耗，血清铁传递蛋白水平会逐渐降低。补体C3是补体系统中最重要的补体之一，也是血清中含量最高的补体成分，在补体经典激活途径和旁路激活途径中均发挥重要作用。该研究显示，小鼠血清中补体C3的水平在大肠埃希菌感染3小时后显著增加，并在48小时后快速下降，与其他研究结果相似。血清淀粉样蛋白A-1主要由肝细胞合成，在细菌感染的急性反应期，SAA1以游离蛋白进入血浆后，迅速与高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)结合，成为急性期HDL的主要载脂蛋白。该研究显示，SAA1蛋白水平在感染后48-72小时之间显著升高，72小时候则快速降低。

另外，该研究还收集了41例临床血清样品，其中22例为大肠埃希菌血流感染患者，剩余19例为健康人对照，年龄分布为27-87。ELISA结果显示，出TRF外，感染患者血清中的C3和SAA1的蛋白水平与健康对照组存在显著不同（图2）。

图2：感染组与对照组血清中TRF、C3和SAA1蛋白水平的ELISA对比结果。结果表示为平均值±标准差。*P<0.05（非配对t检验）。

最后，该研究验证了血清中TRF、C3和SAA1蛋白是否可以有效的用于血流感染检测，结果表明，与单一生物标志物相比，这三个蛋白的组合标志物可以更好地区分感染组和对照组，AUC可达到0.99（图3）。

图3：用于血流感染诊断的ROC曲线。三种组合生物标志物的最大AUC为0.99，高于单一或两两组合标志物。

综上所述，血清多肽的含量变化不仅可以反映体液中蛋白质含量的变化或异常表达，还可以反映某些疾病的蛋白质总量和动态反应。MALDI-TOF质谱平台是研究血清中多肽变化的有效工具，与LC-MS/MS结合后更可鉴定出血流感染患者中存在明显的蛋白质，为筛选有效的感染检测生物标志提供了强有力的帮助。

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